[发明专利]毕赤酵母转录因子HAC1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母转录因子HAC1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用。是以GgaattcACGATGCCCGTAGATTCTTCTC和ATAAGAATgcggccgcTCACCTGATCGCTATGC为特异引物，以毕赤酵母Pichia p astoris GS115的基因组DNA为模板，采用PCR扩增方法获得毕赤酵母转录因子HAC1，并成功构建了巴斯德毕赤酵母工程菌。本发明解决了目前如果重组蛋白不能正确折叠成天然构象，就会影响异源蛋白正常分泌表达的问题，具有将高效重组微生物技术和蛋白质工程技术相结合，提高了青霉来源GOD酶活等优点。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母转录因子HAC1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用。

背景技术

1928年Muller等人首次于黑曲霉(A.niger)的无细胞提取液中分离出一种脱氢酶，将其命名为葡萄糖氧化酶(简称GOD)；1936年又首次于灰绿青霉(Penicilliumglaucum)中发现GOD。

葡萄糖氧化酶安全、无毒、无副作用，在食品工业、医药、饲料添加等方面应用非常广泛，且商业价值可观。作为国家允许使用的酶制剂之一，近年来市场对葡萄糖氧化酶的需求量逐年增长。但我国葡萄糖氧化酶技术水平尚处于研究发展的初级阶段，存在产量低、酶活低、提纯繁琐等问题，使国内葡萄糖氧化酶仍以进口为主。顾磊等人将黑曲霉来源的GOD通过在毕赤酵母中组合共表达SEC53、CNE1和GCN4基因所得重组菌株，发酵酶活达到1972.9U/mL。郜赵伟等人将点青霉来源的葡萄糖氧化酶基因经过密码子优化实现重组GOD在毕赤酵母中表达，高密度发酵后酶活达到615U/mL。目前在生物传感器领域GOD的应用十分广泛。黑曲霉GOD的糖基化程度高于青霉GOD，较高的糖基化程度限制了传感器中电子从电极迁移到GOD的速率，从而降低了生物传感器的灵敏度。

生产GOD的最常见微生物是曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)和酵母属(Saccharomyces)。霉菌在发酵过程中，菌丝会影响搅拌效果，导致菌体与发酵液接触不良，造成GOD产量低，而且黑曲霉和青霉菌发酵生产GOD过程中，淀粉酶、纤维素酶及过氧化氢酶等大量杂酶的存在给纯化带来相当大的困难；同时还存在着酿酒酵母表达质粒易丢失、GOD高度糖基化、蛋白分泌表达效率低等技术缺陷。

在过去的20多年中毕赤酵母已经发展成为使用最多、最广泛、最具有发展前景的异源蛋白表达系统之一，该表达系统具有很多优点：其含有甲醇诱导的强启动子AOX1；操作技术简单、遗传稳定；具有将外源蛋白分泌到胞外的信号肽，方便了后期的分离纯化；作为真核生物，具有许多真核蛋白翻译后修饰的能力；发酵培养基成本低廉、设备简单、适合高密度生长。

然而在使用毕赤酵母表达系统生产重组蛋白时也会面临诸多问题，并不是每种异源蛋白质都能在酵母中高效表达和分泌。如果重组蛋白不能正确折叠成天然构象，就会影响异源蛋白的正常分泌表达。影响毕赤酵母中的外源蛋白分泌表达的因素，主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力。

HAC1蛋白参与内质网中未折叠蛋白响应(UPR)信号通路，是毕赤酵母中的一个转录因子，能够调控分泌表达途径中的下游靶基因，这些基因包含了各种分子伴侣、折叠因子、内质网中参与糖基化控制以及其他胞内胁迫条件下调控因子的编码基因。

申请人检索的对比文件包括：

申请号为201410606913.8的专利文献中公开了一种强化毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法，出发菌株为黑曲霉的GOD做的异源表达，其酶活表达水平为1634.7U/mL。黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶失去辅基FAD后无法恢复活性；且来自黑曲霉GOD比青霉属的GOD催化效率低。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种毕赤酵母转录因子HAC1。