[发明专利]一种提高D-酪氨酸生产效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高D‑酪氨酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段构建了一株双质粒共表达的重组菌，同时实现三种酶的高效表达，将L‑酪氨酸转化为D‑酪氨酸，并通过偶联辅酶再生系统，将NADP⁺转化为NADPH，使得NADPH循环再生，转化能够高效进行。并通过优化全细胞转化条件，实现了D‑酪氨酸的高效生产。通过本发明生产的D‑酪氨酸产量可达8.4g/L，转化率达93％。

技术领域

本发明涉及一种提高D-酪氨酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-酪氨酸是一种非天然手性氨基酸，是多肽药物和抗肿瘤手性药物的重要中间体。以D-酪氨酸为手性前体可合成阿托西班、多肽、茴香霉素等物质，其中，阿托西班是一种保胎药；多肽在恶性肿瘤的治疗中具有特殊疗效；茴香霉素能够抗原虫、抗真菌、抗变形虫和抗肿瘤。

目前，D-酪氨酸的合成方法主要包括化学拆分法、生物拆分法和酶转化法。化学拆分法面临拆分试剂贵、反应条件苛刻、产物收率低的问题。生物拆分法是利用普通变性杆菌细胞为生物催化剂，选择性降解D/L-酪氨酸中的L-酪氨酸来制备D-酪氨酸，但收率也极低。而酶转化法反应条件温和、立体选择性高、效率高，且方便快捷易操作，具有广阔的工业化开发前景。但目前有关酶转化法生产D-酪氨酸的报道较少，有文献利用奇异变形杆菌来源的L-氨基酸脱氨酶、嗜热共生细菌来源的D-氨基酸脱氢酶转化L-酪氨酸来生产D-酪氨酸，并利用稳定伯克霍尔德菌来源的甲酸脱氢酶来实现辅酶NADPH的再生。但该级联系统对L-酪氨酸的转化率较低，只有45.3％。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的重组菌，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、D-氨基酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，所述双质粒包括pRSFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述pRSFDuet-1质粒用于表达L-氨基酸脱氨酶，所述pACYCDuet-1质粒用于表达D-氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶(L-AAD)选自奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码L-氨基酸脱氨酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述D-氨基酸脱氢酶(D-AADH)选自文献中报道的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码所述D-氨基酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶(GDH)选自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码所述葡萄糖脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。

本发明第二个目的在于提供了一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法，所述方法为利用上述重组菌将L-酪氨酸转化为D-酪氨酸，并偶联辅酶再生体系。

在本发明的一种实施方式中，所述辅酶再生系统以D-葡萄糖为底物，通过葡萄糖脱氢酶将NADP⁺转化为NADPH的辅酶再生系统。

在本发明的一种实施方式中，所述转化的体系中，L-酪氨酸浓度为50～150mmol/L，D-葡萄糖浓度为300～900mmol/L，氯化铵浓度为500～1500mmol/L，NADP⁺浓度为0.4～0.6mmol/L，所述重组菌经培养后以菌液的形式添加，转化温度为15～37℃，转化pH为7～9，转化的时间为20～24h。