[发明专利]一种液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法

说明书

本发明目的在于提供一种可以准确测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法。本发明的方法突破了内源干扰检测的难点，并且具有专属性强、准确度和灵敏度较高的特性。本发明采用液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸的浓度，该方法包括：(1)替代基质的选择；(2)对照基质中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的确定(3)工作曲线样品的制备及前处理；(4)质控样品的制备及前处理；(5)分离分析条件；(6)采用内标法，以系列高香草酸/香草扁桃酸在替代基质中的浓度为横坐标，高香草酸/香草扁桃酸与内标甲苯黄丁脲的峰面积比为纵坐标，通过使用权重因子1/x2，线性回归得到理论浓度与响应之间的线性关系进行定量。

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，特别涉及一种检测人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法。

背景技术

儿茶酚胺是由肾上腺髓质，肾上腺神经元及肾上腺外嗜铬体分泌的激素，主要包括肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺。过多的儿茶酚胺分泌可能导致高血压和心肌梗塞；而低水平的儿茶酚胺可能引起低血压、心肌缺血等的发生。在临床上，儿茶酚胺降低常见于帕金森病、癫痫、肾上腺切除后、风湿热、营养不良等病症；升高常见于嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤、脑梗死、重症肌无力、进行性肌营养不良、低血糖、心肌梗死、躁狂性精神病等。神经母细胞瘤是儿童常见的实体瘤之一，发病率约占全部恶性肿瘤患儿的7％，病死率达15％，仅次于白血病(SMITH E I,CASTLEBERRY R P.neuroblastoma,CurtProbl Surgt,l990,27(9):573-620.)。高香草酸和香草扁桃酸作为儿茶酚胺在尿液中的终末代谢产物，在早期神经母细胞瘤患儿的尿液中浓度就会明显升高，可以通过检测尿液中高香草酸和香草扁桃酸的含量来进行早期神经母细胞瘤的诊断(GITLOW S E,BERTANI L M,RAUSEN A,etal.Diagnosis of neuroblastoma by quantitative and qualitative determinationof catecholamine metabolites in urine.Cancer,1970,25(6):1377.)。因此，高香草酸和香草扁桃酸不仅可以作为临床疾病检测的指标，还可以用此类抗肿瘤药物治疗效果的生物标志物进行研究。但是，高香草酸和香草扁桃酸作为内源性物质，能否准确定量是检测的难点。本发明基于替代基质法，建立了一种科学、快速和准确的液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法，本发明的方法可以用于准确、简便和快速地评价患者治疗的体内药效。

本发明的技术方案概述如下：

(1)替代基质的选择

本发明使用“相对加标回收率”法，来筛选合适的替代基质。以人工尿液和生理盐水(含0.1％BSA):6mol/L HCl(100:1,v/v)作为代替基质考察不同代替基质的加标回收率；10.0mg/mL的高香草酸和香草扁桃酸储备液用含5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸的甲醇溶液稀释为高浓度质控工作液(320μg/mL)、中浓度质控工作液(200μg/mL)和低浓度质控工作液(20.0μg/mL)的系列质控工作液，分别加入到替代基质和人尿液中，配制空白样品、低浓度质控样品、中浓度质控样品和高浓度质控样品，结果代入相对加标回收率进行计算，相对加标回收率接受标准：三个浓度的相对加标回收率在85％～115％之间，且％CV不超过15％。计算公式如下：

％相对加标回收率＝(spiked SM–blank SM)/(spiked SM–blank SM)

spiked SM＝加标代替基质中分析物与内标的峰面积比值

blank SM＝空白代替基质中分析物与内标的峰面积比值

spiked CM＝加标对照基质中分析物与内标的峰面积比值