[发明专利]一种提高脐带血利用率的方法

权利要求书

1.一种提高脐带血利用率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）脐带血分离处理：取脐带血，加入淋巴细胞分离液进行离心分离；

（2）提取单个核细胞：取体积为白膜层70~95%的白膜层上层液体，再离心分离得到其中的单个核细胞；

（3）制备内皮祖细胞：取剩下的白膜层分层液，收集其中的细胞，重悬于内皮祖细胞培养基中，进行原代培养得到内皮祖细胞；

所述步骤（3）中内皮祖细胞的制备方法为：将取得的白膜层细胞接种于内皮祖细胞原代培养基，连续培养四天，第五天更换培养基；以后每3天更换培养基，并观察内皮祖细胞集落的生长情况，单个集落的细胞数大于1000个，即进行传代培养；

所述内皮祖细胞原代培养基为含有EGM-2MV的EBM培养基。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中取体积为白膜层70~80%的白膜层上层液体分离单个核细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中脐带血处理的具体方法为：脐带血在采集后24小时内进行实验操作，轻缓地加到淋巴细胞分离液的液面上，所述脐带血与所述淋巴细胞分离液体积比为2：1，800g离心20分钟。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将所述步骤（2）的单个核细胞诱导培养，分化为巨核祖细胞；所述巨核祖细胞的制备方法为：将所述单个核细胞接种于巨核祖细胞诱导培养基，连续培养7天，在第4天加入50%原始体积的巨核祖细胞诱导培养基；

所述巨核祖细胞诱导培养基为Stemspan培养基，所述Stemspan培养基含有如下组分：15 μmol/L白黎芦醇、20 ng/mL IL-3、40 ng/mL IL-6、50 ng/mL SCF和40 ng/mL TPO。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤（4）制备内皮祖细胞外泌体：扩增培养步骤（3）的内皮祖细胞，收集培养基中的内皮祖细胞外泌体；

所述步骤（4）中内皮祖细胞外泌体的制备方法为：取传代培养至第四代的内皮祖细胞，继续培养24小时后加入IL-8并使其终浓度为12ng/mL，再培养72小时；收集培养基，通过超高速离心即得到所述内皮祖细胞外泌体。