[发明专利]一种检测ANNK1基因rs1800497位点的实时荧光PCR方法及其引物探针组合

权利要求书

1.一种应用于检测ANNK1基因rs1800497位点等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR法的特异性引物探针组合，其特征在于，包括以下特异性的上游引物(ARMS)、通用下游引物和探针序列：

上游引物FpC:5’-AGCTGGGCGCCTGCCGC-3’，

上游引物FpT:5’-AGCTGGGCGCCTGCCGT-3’，

下游引物Rp：5’-GCAAATGTCCACGCCCGCA-3’，

探针Probe：5’-FAM-AGCACTTTGAGGATGGCTGTGT-BHQ2-3’，

其中，FAM为6-carboxyfluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

2.权利要求1所述的特异性引物探针组合在制备针对ANNK1基因rs1800497位点等位基因的检测试剂盒方面的用途。

3.权利要求1所述的特异性引物探针组合在构建针对ANNK1基因rs1800497位点等位基因的检测模块或基因分型检测仪器方面的用途。

4.一种检测ANNK1基因rs1800497位点等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，用于非疾病诊断目的，包括以下步骤：

(1)取权利要求1所述特异性引物探针组合；

(2)提取待测样本的基因组DNA；

(3)配置反应体系

分别在两个反应管中构建各自的反应体系，两个反应体系的区别仅在于从所述特异性引物探针组合中选取了不同的上游引物；其他内容均相同，包括被测样本的基因组DNA、所述特异性引物探针组合中的下游引物和探针、内参基因的引物及探针、5×HS HiTaqBuffer(Mg²⁺Plus)、Solution I(10×)、dNTP、HotstartHiTaq DNA polymerase；两个反应体系各自进行混合(Mix)；

(4)PCR反应

将配置好的反应体系在实时荧光PCR仪ViiA^TM7上进行扩增，PCR完成后，根据扩增曲线的有无判断被测样本的基因型。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

选择的内参基因为ACTB，设计的内参基因引物和探针为：

上游引物ACTB-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’；

下游引物ACTB-R：5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’；

探针ACTB-P：5’-HEX-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ2-3’；

其中，HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

以单管反应体系10μl计，反应管中加入特异性的上游引物200～250nM，通用下游引物200nM，荧光探针100nM；内参基因上下游引物各150～200nM，探针100nM，被测样本基因组DNA10～50ng，HotstartHiTaq DNA polymerase 0.1375μl，5×HS HiTaq Buffer(Mg²⁺Plus)2μl、Solution I(10×)1μl、2.5mM dNTP1μl、ddH₂O补充至终体积10μL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

PCR反应参数设置如下：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火40sec；共计40个循环。