[发明专利]一种水稻全生长期磷酸化蛋白质组数据库建立及定量方法

权利要求书

1.一种水稻全生长期磷酸化蛋白质组数据库建立及定量方法，包括：

1)将幼年期及成熟期的水稻地上部分分别进行蛋白提取及酶解，得到两类酶解肽段；

2)将部分两类酶解肽段等量混合后进行色谱分离，再进行磷酸化肽段富集；部分两类酶解肽段不经过色谱分离，分别直接进行磷酸化肽段富集；

3)对分离后富集的磷酸化肽段通过DDA模式采集原始数据并建立相应的DDA数据库；

4)对直接富集的磷酸化肽段通过DIA模式采集原始数据并用DDA数据库搜库。

2.根据权利要求1所述的一种水稻全生长期磷酸化蛋白质组数据库建立及定量方法，其特征在于，步骤2)包括：将部分两类酶解肽段等量混合后进行离子交换色谱分级，收集洗脱的馏分，根据色谱峰图合并馏分，再进行磷酸化肽段富集。

3.根据权利要求1所述的一种水稻全生长期磷酸化蛋白质组数据库建立及定量方法，其特征在于，步骤3)和4)中，分别将需要上机的磷酸化肽段混入iRT标准肽段，采用纳升流速高效液相系统进行分离，样品经液相色谱串联质谱进行DDA和DIA两种模式分析以采集原始数据。

4.根据权利要求3所述的一种水稻全生长期磷酸化蛋白质组数据库建立及定量方法，其特征在于，液相色谱串联质谱的色谱条件：缓冲液A为0.1％甲酸水溶液，缓冲液B为0.1％/80％甲酸乙腈水溶液，样品上样到上样柱，再经分析柱分离，流速为300nL/min，相关分离梯度如下：0～60min，8～25％缓冲液B；60～79min，25～45％缓冲液B；79～80min，45～100％缓冲液B；80～90min，100％缓冲液B。

5.根据权利要求3或4所述的一种水稻全生长期磷酸化蛋白质组数据库建立及定量方法，其特征在于，DDA模式参数设置为：扫描时间90min，离子模式正离子，一级质谱分辨率120000@m/z200，最大注入时间100ms，扫描范围350-1650m/z；二级扫描分辨率30000@m/z200；最大注入时间80m；选TOP20一级母离子做二级质谱；分离窗口为1.4m/z；碰撞能量27％；动态排出时间为40s。

6.根据权利要求3或4所述的一种水稻全生长期磷酸化蛋白质组数据库建立及定量方法，其特征在于，DIA模式参数设置为：扫描时间90min，离子模式正离子，一级质谱分辨率120000@m/z200，最大注入时间100ms，扫描范围350-1300m/z；二级扫描分辨率30000@m/z200；最大注入时间Auto；碰撞能量28％；分离窗口为26m/z；32个可变窗口设置如下：m/z400-426，m/z 425-451，m/z 450-476，m/z475-501，m/z 500-526，m/z 525-551，m/z 550-576，m/z 575-601，m/z 600-626，m/z 625-651，m/z 650-676，m/z 675-701，m/z 700-726，m/z 725-751，m/z 750-776，m/z 776-801，m/z 800-826，m/z 825-851，m/z 850-876，m/z875-901，m/z 900-926，m/z 925-951，m/z 950-976，m/z976-1001，m/z 1000-1026，m/z1025-1051，m/z 1050-1076，m/z 1075-1101，m/z 1100-1126，m/z 1125-1151，m/z 1150-1176，m/z1175-1201。

7.根据权利要求1所述的一种水稻全生长期磷酸化蛋白质组数据库建立及定量方法，其特征在于，步骤3)中，将DDA模式采集的原始数据导入分析软件Spectronaut进行建库。

8.根据权利要求1所述的一种水稻全生长期磷酸化蛋白质组数据库建立及定量方法，其特征在于，步骤4)中，将DIA模式采集的原始数据导入分析软件Spectronaut进行分析，选用DDA数据库进行搜索。