[发明专利]一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法

说明书

本发明公开了一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法，包括如下步骤：(1)阻隔物与生物分子结合；(2)PEG化生物分子；(3)将阻隔物与生物分子分离。另一方面，本发明公开了一种制备结合位点可控的PEG化IL‑2的方法，包括如下步骤：(1)将IL‑2与IL‑2α受体结合，封闭IL‑2的α结合位点；(2)PEG化，PEG与IL‑2偶联；(3)将IL‑2与IL‑2α受体分离。通过对IL‑2的结合位点进行调控，PEG化过程中只添加1或2个PEG，使IL‑2选择性的结合IL‑2Rβγ类受体。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体的涉及一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方 法。

背景技术

白细胞介素-2(IL-2)是由植物血凝素(PHA)等分裂原刺激淋巴细胞增殖时产生的。 近来对该因子及其受体的研究日益深入，发现它在细胞免疫、体液免疫及免疫调节中起重 要作用。特别是在肿瘤免疫治疗中的作用及临床意义受到许多作者的重视。

IL-2大多数由CD4+的T辅助细胞(Th)产生的，少数由CD8+及其它免疫细胞产生。这些细胞在IL-1作用下能分泌IL-2。淋巴细胞产生的IL-2作用于表面带IL-2受体的细胞，使细胞增殖而发挥其生物学功能，可作用于正常T、B淋巴细胞、NK细胞的前体细胞、细 胞毒T细胞(CTL)以及淋巴因子活化的杀伤细胞的前体细胞等。IL-2的生物学功能包括： 1，维持活化后T细胞体外长期生存，并保持其生物学功能活性，一些受肿瘤抗原激活的T 细胞在IL-2作用下，可增强其杀伤肿瘤细胞的功能，加强抗肿瘤作用；2，促进B细胞增 殖，分化并产生抗体；3，刺激粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及γ-干扰素等的分泌，促进 淋巴细胞表达这些受体；维特亚剂量促分裂原存在时胸腺的增殖；促进IL-2受体表达，参 与机体免疫调节系统，维持免疫平衡和稳定。

IL-2是最早的免疫治疗药物。早在1992和1998年，美国FDA就批准了IL-2药物阿地白介素(Aldesleukin)用于晚期肾癌和恶性黑色素瘤，有效率在15％-20％，能使近10％-15％的患者存活期超过5年。不过，由于临床使用的剂量很高，IL-2的副作用很大， 比如严重的低血压和血管渗漏综合征。在当时，使用IL-2治疗的患者必须住院，24小时 密切观察，稍有不慎就有生命危险。所以，巨大的副作用限制了IL-2的使用，多数临床医 生并不敢轻易碰它。

IL-2的作用机理如下：IL-2主要由经抗原刺激后的CD4+T细胞产生，CD8+T细胞，NK细胞和DC细胞也可以分泌。高剂量的IL-2可以促进CD4+T细胞的分化，CD8+T 细胞和NK细胞的增殖，增加他们的杀伤力从而调动机体的免疫反应。反过来，低剂量的 IL-2会促进调节性T细胞的增殖，对免疫系统起到抑制的作用，因此低剂量的IL-2也 常常用来治疗自身免疫性疾病。

之所以有此不同主要是因为免疫细胞表面IL-2受体分布不同，IL-2受体共有三个亚 基构成α，β，γ亚基。CD8阳性T细胞和NK细胞等起杀伤性细胞表面受体主要是β和 γ亚基构成(IL-2Rβγ)，该受体对IL-2亲和力较低，需要大剂量IL-2才能激活。而调节 性T细胞表面多为α，β，γ三个亚基组成的高亲和抗体(IL-2Rαβγ)，低剂量的IL-2更 容易激活他们从而起到免疫抑制作用。

IL-2早在20多年前就被批准治疗肾细胞瘤和转移性黑色素瘤，却一直身处免疫治疗 的冷宫，鲜有使用。究其原因主要是以下几点：1，有效率低，单用IL-2的有效率只能达到15-20％左右；2，IL-2功能双面性，低剂量IL-2促进调节性T细胞的增殖引起免疫 抑制，如何调和这两个功能尚待解决；3，半衰期短，只有几分钟，想要持续起效必须要 大剂量给药；4，不良反应严重，过度激活的免疫系统有可能会攻击自身脏器造成器官衰 竭，剂量窗口比较窄。为了提高IL-2的疗效，降低不良反应，科学家们还尝试了各种联 用方案，比如IL-2+干扰素，IL-2+淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞疗法，IL-2+化疗等， 效果均不理想。