[发明专利]利用恶性胸腹水制备悬浮肿瘤细胞类器官的方法

说明书

本公开涉及一种利用恶性胸腹水制备悬浮肿瘤细胞类器官的方法，其特征在于，该方法包括：a、获取恶性胸腹水中的游离细胞，其中，游离细胞包括第一游离细胞和第二游离细胞，第一游离细胞来源于恶性胸腹水的液体部分，第二游离细胞来源于恶性胸腹水的凝块部分；b、获取游离细胞中含有的单核细胞和肿瘤细胞，得到原料细胞；c、将原料细胞与琼脂糖凝胶、培养基混合，进行预培养，得到预培养细胞；d、将预培养细胞与琼脂糖凝胶、培养基混合，培养12‑15天，得到悬浮肿瘤细胞类器官。本公开的方法培养得到的悬浮肿瘤细胞类器官的生物学效应与恶性胸腹水中的悬浮肿瘤细胞的生物学特性的契合度较高，具有抗失巢凋亡的恶性肿瘤细胞特性。

技术领域

本公开涉及生物医药技术领域，具体涉及一种利用恶性胸腹水制备悬浮肿瘤细胞类器官的方法。

背景技术

恶性胸腹水是指由于发生在全身或胸腹腔的恶性肿瘤或癌性病变引起胸腔、腹腔脏壁层胸腹膜发生弥漫性病变而导致体腔液体异常增多的现象。恶性胸腹水是肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌及卵巢癌等癌症病患因肿瘤胸腹腔转移而出现的常见临床病征，大量临床研究证据表明恶性胸腹水中存在的肿瘤细胞与原发癌灶肿瘤细胞不同，胸腹水肿瘤细胞在体外悬浮状态下仍能继续增殖生长，具有抗凋亡能力，脱离细胞外基质后的凋亡(失巢凋亡)率小于1％，超过50％以上的胸腹水肿瘤细胞处于G0静止期，生长缓慢但因其生长环境为悬浮状态，不受接触抑制作用影响，可持续缓慢生长。这也是大多数临床化疗药物对增殖活跃的肿瘤细胞具有杀伤作用，而对静息状态的肿瘤细胞无法杀伤的原因。从恶性胸腹水中分离肿瘤细胞并在体外建立抗失巢凋亡的悬浮恶性肿瘤细胞模型，可真实性的模拟体内状况，为新型药物开发及癌症转移、复发机制机理研究提供基础。

3D肿瘤类器官能在较高程度上模拟肿瘤细胞生长所需的微环境，保存了肿瘤细胞的异质性、组织特性及基因突变信息，可以在体外模拟癌症的发生、发展过程，用于肿瘤发病机制研究及肿瘤药物研发。

现有技术中，可以利用恶性胸腹水中分离的肿瘤细胞与细胞外基质(如3D-基质胶)混合，在加入多种生长因子及化合物培养基的条件下进行肿瘤细胞体外培养，但是该方法存在培养成功率较低且培养成本高等缺陷，并且往往培养得到的悬浮肿瘤细胞失去了恶性胸腹水中悬浮恶性肿瘤细胞的抗失巢凋亡特性。

发明内容

本公开的目的是提供一种利用恶性胸腹水制备悬浮肿瘤细胞类器官的方法，该方法具有培养成功率高且培养成本较低的优势，培养得到的悬浮肿瘤细胞类器官具有恶性胸腹水中悬浮恶性肿瘤细胞的抗失巢凋亡特性，与恶性胸腹水中的悬浮肿瘤细胞的生物学特性的契合度较高。

为了实现上述目的，本公开提供一种利用恶性胸腹水制备悬浮肿瘤细胞类器官的方法，该方法包括：

a、获取恶性胸腹水中的游离细胞，其中，所述游离细胞包括第一游离细胞和第二游离细胞，所述第一游离细胞来源于所述恶性胸腹水的液体部分，所述第二游离细胞来源于所述恶性胸腹水的凝块部分；

b、获取所述游离细胞中含有的单核细胞和肿瘤细胞，得到原料细胞；

c、将所述原料细胞与琼脂糖凝胶、培养基混合，进行预培养，得到预培养细胞；

d、将所述预培养细胞与琼脂糖凝胶、培养基混合，培养12-15天，得到悬浮肿瘤细胞类器官。

可选地，所述培养基中含有1640培养基和生长因子，所述生长因子包括A83-01、Noggin、FGF7、FGF10、Y-27632、Nicotinamide、EGF和BSA中的至少一种。

可选地，所述生长因子中，A83-01的浓度为300-600ng/mL，Noggin的浓度为50-150ng/mL，FGF7的浓度为2-10ng/mL，FGF10的浓度为10-30ng/mL，Y-27632的浓度为3-8μmol/L，Nicotinamide的浓度为3-8mmol/L，EGF的浓度为3-8ng/mL，BSA的浓度为1-5mg/mL。