[发明专利]一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体为一种具有较髙棒状杆菌复制能力的表达质粒，所述表达质粒的第1786位点的核苷酸为A或G，其余位点与质粒pXMJ19相同；所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。通过在pXMJ19载体的棒状杆菌复制子调节部位，将第1786位点的核苷酸C进行人工突变，成功获得2株比pXMJ19质粒拷贝能力高6～8.5倍的棒状杆菌/大肠杆菌双用载体pXMJ19C1786A和pXMJ19C1786G质粒，pXMJ19C1786A拷贝数约为115，pXMJ19C1786G质粒的拷贝数约为170。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法。

背景技术

好的基因工程疫苗最大的特点在于它不带任何感染性病毒，因此不会引起由病毒感染带来的毒副作用，从而更加安全可靠。此外基因工程疫苗相对于传统疫苗生产过程来说具有更加简便、质量更易控制、更便于储存与运输等优势。作为一类新兴生物技术,基因工程疫苗的应用正在不断拓展,逐渐成为经济社会中疫病防治的发展新趋势。基因工程疫苗主要有两类：一类是核酸类包括DNA和RNA疫苗，另一类是含特异性抗原蛋白的亚单位疫苗。二者均通过抗原蛋白诱导宿主细胞产生应对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。

基因工程疫苗的制备虽可通过生物合成，如直接合成多肽(亚单位疫苗)或合成能在宿主细胞内表达的DNA序列(DNA疫苗)，但无论生物合成多肽还是合成核酸其造价都很高，远不能用于规模化生产，目前基因工程疫苗的制备还完全依赖于细菌或细胞这些相对便宜且易于控制的生物工厂来生产。如蛋白亚单位疫苗的生产途径主要包括制备表达质粒以及蛋白表达与纯化，抗原蛋白的制备过程包括将质粒转化进原核细胞，主要是大肠杆菌或真核细胞(针对需要三维空间或糖基化修饰的抗原蛋白)进行转录和翻译从而产生抗原蛋白作为蛋白亚单位疫苗的原材料。DNA疫苗制作过程包括把抗原基因克隆到能在真核内表达的载体拟获得表达该抗原基因的质粒，再将该质粒转化进大肠杆菌，让质粒先在细菌这个廉价工厂中大量扩增，再通过一系列步骤将质粒DNA从细菌工厂中提取出来，DNA疫苗经肌肉注射或微弹轰击等方法导入宿主体内，通过宿主细胞将疫苗携带的抗原基因表达成抗原蛋白。比之蛋白疫苗其优点是抗原蛋白在宿主体内合成，能被正确地折叠和修饰，抗原性强，由于疫苗的主要成分是DNA因此更易储存和运输。但由于进入宿主细胞的外源DNA不能在宿主细胞内复制因此能进入宿主细胞的DNA的量是除抗原自身的效价外影响疫苗效力的另一关键因素。

目前无论直接用作DNA疫苗的质粒还是用于生产抗原蛋白的质粒都是带大肠杆菌复制子的质粒，这类质粒只能在大肠杆菌中复制，由于大肠杆菌是格兰式阴性菌，含有大量内毒素，通过该菌种制备质粒最严重的问题就是产生内毒素污染，因为内毒素是重要的致热源，能产生严重毒副作用，国家食品药品监管局对其有严格的要求。此外，目前用于表达抗原蛋白的宿主细胞主要也是大肠杆菌，由大肠杆菌进行大规模抗原蛋白表达常用的纯化方法也很难避免内毒素污染，为此寻找新的更好的抗原表达质粒仍然是基因工程疫苗生产的重大攻关难题之一。

为了避免内毒素污染，最直接的方法就是避免使用大肠杆菌来生产质粒或表达蛋白，然而目前已商业化的质粒基本上全是只能在大肠杆菌内复制的质粒。棒状杆菌基于它不产生内毒素越来越受到科学工作者的青睐，谷氨酸棒状杆菌不仅已广泛用于微生物发酵工程生产谷氨酸(味精)，近年来人们也开始探讨，研发它在蛋白生产方面的应用，并受到越来越广泛的关注。然而有关棒状杆菌生物代谢和细菌复制的研究远不及大肠杆菌那样深入和全面，因而推广到市面上的能在棒状杆菌内复制的商业化载体非常少见，并且它们的拷贝能力属于中低范围，低的拷贝能力直接导致产量低下从而推高成本，很难用于大规模生产。