[发明专利]羟腈裂解酶突变体及在(R)-沙美特罗合成中的应用

说明书

本发明涉及羟腈裂解酶突变体及其基因与应用，该羟腈裂解酶突变体是对如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第72位、73位、76位、110位、329位、331位、333位、340位、343位和358位组氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。与野生型羟腈裂解酶相比，本发明所述羟腈裂解酶突变体对2,2‑二甲基‑苯并[1,3]二噁烷6‑甲醛等大位阻底物醛的羟氰化活性和立体选择性均有大幅度提高，所述羟腈裂解酶的突变体尤其适合催化2,2‑二甲基‑苯并[1,3]二噁烷6‑甲醛，高效制备其相应的(R)‑氰醇中间体，可用于合成手性药物(R)‑沙美特罗，因此具有很好的工业合成应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体是涉及一种羟腈裂解酶突变体及其基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，及该羟腈裂解酶突变体的制备，以及羟腈裂解酶突变体在(R)-沙美特罗合成中的应用。

背景技术

在现代合成化学中，通过最理想的逆合成分析，巧妙解构合成单元是发展高效合成路线的重要手段。相较于传统的过渡态金属及其络合物催化，生物催化具有高效、专一的催化性能，其最大优势在于操作条件温和、高度专一的化学选择性和理想的立体选择性，酶促反应产物的光学纯度可达近乎完美(99％ee)的程度，这在复杂天然产物或是药物活性分子的合成应用中尤为重要。另一方面，伴随着克隆表达技术的快速发展，通过简单发酵大规模制备理想生物催化剂成为可能。由于生物催化技术与“可持续发展”、“绿色化学”、“环境友好制造”等工业发展的目标相一致，已成为新一代合成化学产业转型升级中极具吸引力的技术之一。

通过逆合成分析解构目标分子为结构单元时，C-C键与C-X键(此处：X代表杂原子)的形成是最为重要的反应。而在现有的生物催化剂工具箱中，仅有羟腈裂解酶(hydroxynitrile lyases,HNLs)可以立体选择性催化C-C键的生成并引入氰基或其他潜在的C-N键(Angew.Chem.Int.Ed.,2017,56,8942–8973)。羟腈裂解酶立体选择性催化所产生的手性氰醇很容易转化为β-氨基醇、α-羟基酸、α-氰基酯、α-卤代腈、α-叠氮腈、α-羰基腈、α-羟基酯等重要合成中间体。目前，羟腈裂解酶的研究历史已经超过一个世纪，基于羟腈裂解酶的催化已经合成了许多具有重大工业价值的手性α-氰醇。例如，来源于巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)的(S)-羟腈裂解酶(HbHNL)，能催化3-苯氧基苯甲醛与氢氰酸不对称加成制备(S)-3-苯氧基扁桃腈，后者是拟除虫菊酯类杀虫剂化合物的前体，其时空产率高达1000g L^-1d^-1，产物的ee值高于98.5％(Chim.Oggi.1998,16,15-19)。类似地，利用固定化的HbHNL在微水相体系中催化2-呋喃醛的不对称羟氰化所制备的氰醇，经过硼氢化钠与三氟乙酸原位生成的硼烷还原，可大规模制备(R)-2-氨基-2-呋喃基-乙醇，产物ee99.5％(Org.Process Res.Dev.2006,10,618-621)。使用分子工程改造的苦杏仁(Prunusamygdalus)羟腈裂解酶的5号同工酶作为催化剂，催化2-氯苯甲醛的不对称羟氰化反应，合成抗凝血剂氯吡格雷的前体(R)-2-氯扁桃腈，6h时转化率达到98％以上，产物的ee值高于98％，反应的时空产率达到250g L^-1d^-1(Angew.Chem.Int.Ed.2003,42,4815–4818；ChemBioChem.2008,9,58–61)。