[发明专利]一种发酵法制备门冬酰胺酶的方法

权利要求书

1.一种发酵法制备门冬酰胺酶的方法，包括种子菌斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养，其特征在于：

(1)种子菌斜面培养：将大肠杆菌菌种接种在LB固体培养基上培养，培养结束后进行菌种筛选，并在LB固体斜面培养基上进行培养；

所述LB固体培养基和LB固体斜面培养基的组分一致，均为：蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂粉；

(2)摇瓶培养：将（1）中已长好的斜面菌种接入摇瓶内，振荡培养；

(3)种子罐培养：将（2）中已培养好的摇瓶菌种接入种子罐中，在通气条件下搅拌培养；

(4)发酵罐培养：将（3）中培养好的种子罐菌种移入发酵罐，接种量为5%-10%，在通气状态下搅拌培养，然后离心，收集菌体；

上述(2)~(4)中的摇瓶培养基、种子罐培养基和发酵罐培养基中的各种组分的质量比例均为：20%玉米浆30~90g/L、蛋白胨5~20g/L、谷氨酸钠5~15 g/L，pH 7.5-7.8；

在步骤(3)中所述的种子罐培养中，所通气的通气量为（2%-20%）v/v/min；

在步骤(4)中所述的发酵罐培养中，所通气的通气量为菌密度*（0.5%-5%）v/v/min；

所述大肠杆菌菌种为组成型表达的大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的发酵法制备门冬酰胺酶的方法，其特征在于：所述LB固体培养基和LB固体斜面培养基中各种组分的质量比例为：蛋白胨5~20 g/L、酵母粉5~10 g/L、氯化钠5~10 g/L、琼脂粉10~25 g/L。

3.根据权利要求1所述的发酵法制备门冬酰胺酶的方法，其特征在于：步骤(3)中的通气量为（2%-15%）v/v/min；步骤(4)中的通气量为：菌密度*（0.5%-3%）v/v/min。

4.根据权利要求1所述的发酵法制备门冬酰胺酶的方法，其特征在于：所述LB固体培养基和LB固体斜面培养基，121℃灭菌30min，冷却至40-50℃，加入一定量抗生素溶液，凝固，冷藏待用。

5.根据权利要求1所述的发酵法制备门冬酰胺酶的方法，其特征在于：所述门冬酰胺酶的具体制备过程为：

(1)种子菌斜面培养：将大肠杆菌菌种接种在LB固体培养基平板上，在37℃下培养12-24小时，培养结束后挑选单菌落进行菌种筛选，并选择高产酶的单菌落在LB固体斜面培养基上进行划线培养12-24小时；

(2)摇瓶培养：摇瓶培养使用500ml摇瓶，装液量200ml，121℃灭菌30min，冷却后接入一定量的抗生素溶液及（1）中已长好的斜面上的菌种，在37±2℃，转速200 -250转/分的恒温培养器中振荡培养6-12小时；

(3)种子罐培养：种子罐采用200升发酵罐，以装量100升计，将100升已经配好的培养基加入该200升发酵罐中，灭菌，待温度下降至37℃时，将（2）中已培养好的摇瓶菌种接入种子罐中，在37±2℃，转速100-200转/分，在通气条件下总共培养时间4-12小时；

(4)发酵罐培养：发酵采用3000升发酵罐，实际装量为2000升，减去种子罐菌种100升，实际配培养基量为2000-100=1900升，将1900升已经配好的培养基装于该3000升罐中，灭菌，冷却至37℃时，将（3）中培养好的种子罐菌种移入发酵罐，接种量为5%-10%，在通气状态下，在37±2℃，转速100-200转/分，总共培养时间6-20小时，然后离心，收集菌体。