[发明专利]一种高通量测序用核酸接头和文库构建方法

说明书

本发明涉及高通量测序技术领域，具体涉及一种高通量测序用核酸接头和文库构建方法。本发明的核酸接头包括接头1和接头2，所述接头1为双链不等长寡核苷酸，包括长链和短链，所述长链的5’端为磷酸化修饰，所述长链的3’端和所述短链的3’端为能够阻断3’磷酸二酯键形成的修饰；所述接头2为单链寡核苷酸；所述接头2包含与所述接头1的长链5’端的互补区。该接头可有效减少接头自连的发生，实现了在接头连接后无需纯化可直接进行PCR扩增，构建的文库无明显的接头二聚体污染，有效降低了DNA样本的损失，提高了文库构建的效率和质量。

技术领域

本发明涉及高通量测序技术领域，具体涉及一种高通量测序用核酸接头和文库构建方法。

背景技术

随着测序技术的发展，基因组测序已经成为一种常规科学研究和临床诊断技术。高通量测序技术(下一代测序技术，NGS)通过在高密度芯片上实现大规模平行测序，具有数据产量高、单位数据成本低的特点，极大地推动了测序技术的实际应用。NGS测序过程中需要对样本DNA进行繁杂的文库构建步骤，文库构建过程中的DNA损失问题会影响测序质量，尤其是面对低投入量时，如何有效减少文库构建过程中多步纯化带来的DNA损失，充分利用投入DNA的遗传信息，提高DNA文库构建的成功率，是高通量测序技术改进和优化的关键要素之一。

目前，高通量测序技术常用的文库构建流程如下：(1)对全基因组DNA进行片段化(可选)；(2)对片段化产物进行末端修复加“A”；(3)对加“A”产物进行接头连接；(4)对连接产物进行纯化收集；(5)对收集的接头连接产物进行PCR扩增；(6)对PCR扩增产物进行纯化收集。以上6个步骤中存在2步纯化操作，步骤繁琐；多次纯化耗时长、成本高；并且多步纯化不可避免地增加了DNA样本的损失。但是，若简化纯化步骤，例如：省略步骤(4)的纯化步骤直接进行步骤(5)的PCR过程，则会产生明显的接头二聚体等污染，影响后续的文库质量。因此，开发高效的接头，减少接头二聚体的产生对于提高文库构建效率和质量具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种高通量测序用核酸接头、利用该核酸接头的接头连接方法以及利用该核酸接头进行文库构建和高通量测序的方法。

在高通量测序中，不同测序平台使用的接头序列往往不同，但受接头的一般序列结构和长度的影响，在将DNA模板与接头连接过程中，接头之间自连的现象很难避免。本发明通过设计多种具有不同结构组成和末端修饰方式的接头，将其进行对比、组合和筛选，获得了一种性能优异的接头结构，其为双接头，其中一个接头是双链不等长寡核苷酸，另一个接头是单链寡核苷酸，两个接头的末端修饰采用特定的修饰方式。利用该接头进行文库构建能够有效降低接头之间的自连，实现在接头连接后可省略纯化步骤直接进行PCR扩增。

具体地，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种核酸接头，其包括接头1和接头2，所述接头1为双链不等长寡核苷酸，包括长链和短链，所述长链的5’端为磷酸化修饰，所述长链的3’端和所述短链的3’端为能够阻断3’磷酸二酯键形成的修饰；所述接头2为单链寡核苷酸；所述接头2包含所述接头1的长链5’端的互补区和所述接头1的长链非互补区。

上述具有特定结构和特定末端修饰的接头1和接头2配合作用能够在有效减少接头自连，尤其是，长链3’端和短链3’端的修饰能够与双接头结构更好地配合，在更高效地降低接头自连的同时保证接头与DNA模板之间的连接效率，相较于仅进行长链的5’端和短链的3’端修饰具有更优的降低接头自连的效果。

本发明的核酸接头的设计示意图如图1所示。

优选地，所述接头1的长链为20～65bp；短链为12～20bp。

优选地，所述接头2的长度为25～35bp，其中，所述接头1的长链5’端互补区的长度为7～12bp。

通过对接头的长度以及互补区的长度设计，在有效降低接头自连率的同时更好地保证了接头与DNA模板之间的连接效率。