[发明专利]一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法

说明书

本发明公开了一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，包括以下步骤：S1、利用植物原生质体制备总蛋白，再将总蛋白超滤后，收集滤液，将滤液样品先经过还原再进行烷基化处理后，得到待测样品；S2、利用液质联用仪对待测样品进行测定，并对测定后的数据进行分析。该方法从没有细胞壁保护的原生质体中提取蛋白质更容易且原生质体更利于保持蛋白与小肽的完整性，不仅操作简单，而且测定结果中假阳性率更低。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法。

背景技术

植物小肽指植物体内介导细胞之间信号转导的小分子信号肽(small signalingpeptides，SSPs)，在植物的生长发育及逆境胁迫响应中起重要的调控作用。与传统植物激素类似，小肽通过其特异性受体感知传导信号而发挥调节功能，因此，小肽逐渐被认为是一类新型的植物激素。成熟具有功能的小肽长度一般不超过20个氨基酸，来源于前体蛋白的降解或剪切。植物小肽既可在胞内传递信号，也可被释放到胞外介导细胞间的信号传递。小肽在动物中的研究已经非常广泛且深入，但在植物中近年来才得到发展。作为小分子信号物质，与植物激素类似，小肽在植物中的含量与作用浓度极低，因此，测定相对困难。随着质谱技术的发展，通过质谱测定分析组学的方法陆续鉴定出一系列小肽。但是由于植物蛋白提取过程复杂，蛋白质断裂形成的小片段较多，质谱测定会产生较多假阳性，如何从植物组织粗提物中分离鉴定出有功能的SSPs，依然是一大挑战。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种方法，能够降低植物小分子信号肽假阳性率。

根据本发明实施例的方法，包括以下步骤：

S1、利用植物原生质体制备总蛋白，再将总蛋白超滤(优选为用5kD超滤管进行超滤)后，收集滤液，将滤液样品先经过还原再进行烷基化处理后，得到待测样品；

S2、利用液质联用仪对待测样品进行测定，并对测定后的数据进行分析；

其中，所述数据的分析过程包括以下步骤：

利用ProteinLynx ProteinPilot软件分析质谱原始数据，自动计算色谱峰宽和质谱峰宽；

利用Paragon Algorithm算法结合ProteinPilot与TAIR蛋白数据库检索蛋白；

利用SignalP5.0在线软件分析所鉴定小肽是否含有信号肽剪切位点。

根据本发明实施例的方法，至少具有如下有益效果：使用植物原生质体代替植物组织进行蛋白质及小肽的提取，避免不必要的较大蛋白质碎裂造成干扰；由于从植物组织中提取蛋白质需要机械粉碎细胞壁且通过机械研磨提取得到的小肽可能是大蛋白中长肽链断裂而产生的假肽，因此，从没有细胞壁保护的原生质体中提取蛋白质更容易且原生质体更利于保持蛋白与小肽的完整性，测定结果中假阳性率更低。

根据本发明的一些实施例，数据分析操作还包括：将蛋白序列比对到GeneOntology Terms(http://geneontology.org/)数据库，鉴定蛋白的功能；

利用NCBI“blastp”蛋白同源比对将以鉴定蛋白注释到TAIR protein database数据库；

利用KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)对所鉴定蛋白进行通路分析；

利用COG数据库(Clusters of Orthologous Groups of Proteins System，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)进行基因的功能注释。