[发明专利]一种艰难梭菌毒素B的PCR荧光检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种艰难梭菌毒素B的PCR荧光检测试剂盒及其应用，属于生物技术领域。该试剂盒主要包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，其中特异性引物和探针由艰难梭菌毒素B、内参片段的特异性引物和探针组成。该试剂盒能精准检测到不同基因型产生毒素B的艰难梭菌，且不会受到其他非艰难梭菌的序列影响，实现高敏感和高特异度，解决了目前引物设计中灵敏度和特异度不能均优的难点问题，同时本发明采用“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，根据拷贝数、引物二聚体和序列空间结构等关键技术参数，寻找最佳靶序列，使检测效率、精准度大大提高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种艰难梭菌毒素B的PCR荧光检测试剂盒及其应用。

背景技术

艰难梭菌又称难辨梭菌、难辨梭状芽孢杆菌或困难梭菌，属厌氧性细菌，一般寄生在人的肠道内。厌氧性细菌是指那些在无氧环境中要比在有氧环境中生长好的细菌，而人的肠道是一个相对无氧的环境。如果过度服用某些抗生素，使肠道菌群失衡，会导致艰难梭菌快速生长，引发炎症、腹泻。快速生长的艰难梭菌产生大量的外毒素A和B。外毒素A是肠道毒素，可侵袭黏膜细胞从而导致出血。外毒素B是一种细胞毒素，在体内外毒素B不能侵袭完整的黏膜细胞，只能侵袭破坏的粘膜细胞，导致粘膜细胞进一步损伤。大多数艰难梭菌属都产生这两种毒素。

艰难梭菌广泛分布于自然生境中，如水、土壤、干草、沙、一些大型动物(牛、驴和马)及狗、猫、啮齿动物和人的肠道及粪便。婴儿的粪便中常含有艰难梭菌，为新生儿肠道中定植菌群，大约50％的12月龄婴儿肠道中有艰难梭菌，2岁以上儿童的带菌率大约为3％，此菌在健康成人中出现频率较低。

艰难梭菌实验室诊断方法如下：(1)培养：菌株培养特异性较高，是获得菌株并进行流行病学调查所必需的，但检测周期长、敏感性低，设备昂贵，需要实验室专业人员操作；(2)酶联免疫试验检测细胞毒素抗体：检测毒素抗体快速、特异，方法重复性差、敏感性低；(3)胶体金法检测细胞毒素的抗原：敏感性低和重复性差。由于上述的实验室检查方法分别有敏感性差，特异性低，检测周期长，设备要求高，重复性差等缺点，使检查结果经常出现假阳性或假阴性，导致误诊、漏诊。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种艰难梭菌毒素B的PCR荧光检测试剂盒，该试剂盒可特异、敏感、准确、快速地检测体液样本中的艰难梭菌毒素B。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：利用自主研发的“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，在国际权威数据库GenBank核酸数据库(Nucleotide)中下载艰难梭菌毒素B的参照序列(GenBank:NC_009089.1,序列全长7100bp，该序列高度保守)。以此参照序列为模板，建立候选短片段文库、片段特异性和敏感度评估、引物设计、引物性能评估、临床样本验证等，在此基础上开发出一种灵敏度和准确率高、特异性强、成本低、检测通量更大的艰难梭菌毒素B的PCR荧光检测试剂盒。本发明的创新之处在于：1)此试剂盒能精准检测到不同基因型产生毒素B的艰难梭菌，且不会受到其他非艰难梭菌的序列影响，实现高敏感和高特异度，解决了目前引物设计中灵敏度和特异度不能均优的难点问题；2)本发明所采用的“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，根据拷贝数、引物二聚体和序列空间结构等关键技术参数，寻找最佳靶序列，使检测效率、精准度大大提高。

本发明所述艰难梭菌毒素B的PCR荧光检测试剂盒包括反应液A与反应液B，反应液A包括两对引物和两个探针：毒素B引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及对应的FAM标记的探针SEQ ID NO.3；内参片段引物对SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5以及对应的HEX标记的探针SEQ ID NO.6。其中HEX、FAM为荧光基团，TAMRA为淬灭基团。反应液B包括热启动酶和UNG酶。

本发明中提供了阴性质控品，阳性质控品。阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为克隆艰难梭菌毒素B基因的工程菌悬液。

内参片段的DNA序列SEQ ID NO.7如下所示：