[发明专利]枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法以及发酵制备的饲料添加剂和制备方法

说明书

本发明公布了一种枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法以及发酵制备的饲料添加剂和制备方法。所用益生菌株为枯草芽孢杆菌菌种保藏编号：CCTCC NO：M2019271，分离自健康鸡肠道内容物。首先，对枯草芽孢杆菌进行液体发酵，并采用液体发酵后期调控温度兼酸碱度的方法，提升了枯草芽孢杆菌活菌数和黄芩素含量，枯草芽孢杆菌活菌数达到148.5×10⁸CFU.mL^‑1和黄芩素含量达到6.48mg.mL^‑1。其次，发酵液与载体吸附，经真空低温冷冻干燥和粉碎，即得饲料添加剂。最后，本发明制备的饲料添加剂中枯草芽孢杆菌活菌数达72.5－84.5×10⁸CFU.g^‑1，黄芩素含量达3.05－3.68mg.g^‑1，主要应用于饲喂肉鸡，在饲料中添加浓度为0.30－0.70wt％，饲喂效果最佳。

技术领域

本发明涉及微生物发酵、中草药转化和畜禽养殖应用技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌发酵产黄芩素的方法以及发酵制备的饲料添加剂和制备方法，还包括添加剂的应用方法。

背景技术

近年来，在畜禽养殖业现代化、规模化的运行模式下，抗生素等在饲料中普遍使用，一方面，预防病菌感染，促进动物生产性能充分发挥，对畜牧业集约化发展做出了重大贡献；另一方面，破坏肠道正常菌群平衡，引起内源性及二重感染，严重导致畜禽产品及环境药物残留。当前，随着饲料中抗生素的全面禁止，迫切需要一种新的替代品，目前，中草药和微生态制剂在畜禽养殖业的应用，已成为国内外学者研究的一个热点，其大规模的开发将对发展绿色养殖，满足人们对食品的安全要求，具有重要的、潜在的生态和社会效益。

黄芩中含有的主要成分为黄芩苷，其次为黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素，具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗微生物、抗病毒、清除自由基等。黄芩苷不易被动物机体直接吸收，需经肠道菌群作用水解成苷元黄芩素后，才能发挥其药效作用，同时大量临床药效实验证明，黄芩素属于黄酮类化合物，其药理作用强于黄芩苷。由于黄芩中游离型苷元(黄芩素)的含量很低(约1％)，主要以结合型的糖苷(黄芩苷)形式存在(含量大于10％)，游离型苷元远不能满足市场需求和临床应用。因此，将黄芩苷转化为黄芩素，提高其药理活性具有重大的实际意义。

目前，黄芩素的提取大多是从药材中直接提取，近年来虽有一些文献报道利用侧耳菌、黑曲霉、米曲霉、青霉、纳豆芽孢杆菌、短乳杆菌对黄芩进行生物转化，并研究认为短乳杆菌葡聚糖酶(转化黄芩苷为黄芩素)属于糖苷水解酶30家族，上述转化过程中，所用菌种也多属真菌类，难免会产生安全性问题，而作为益生菌的纳豆芽孢杆菌，却非肠源固有土著菌种，在动物肠道中能否定殖、发挥益生作用还不明确。

β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase，GUSB)，是一种糖苷类水解酶，多属于糖基水解酶家族2和糖基水解酶家族79，催化各种类型的β-葡萄糖醛酸苷水解产生多种衍生物，在β-葡萄糖醛酸苷酶的催化下，可定向水解黄芩苷为黄芩素。枯草芽孢杆菌菌株(菌种保藏编号：CCTCC NO：M 2019271)为本申请人从健康鸡肠道内容物中筛选出的一株高产β-葡萄糖醛酸苷酶的益生菌菌株，具有天然的耐受胃肠道优势，自身能够发挥益生功效，同时在发酵过程中能够转化黄芩苷生产活性产物黄芩素，双重功效为在畜禽绿色养殖领域开发协同联用的益生菌、黄芩素混合型饲料添加剂提供了技术突破。

现有技术中也有一些关于枯草芽孢杆菌发酵的研究。比如：本申请人前期研究并发表的论文“饲用枯草芽孢杆菌JY24发酵条件的优化”，贵州农业科学2019，47(10)：60-65，采用单因素试验与正交试验相结合的方法筛选JY24菌株摇瓶培养条件和培养基成分，并在此基础上优化培养基成分。结果表明：JY24菌株发酵条件为转速240r.min^-1，温度35℃，初始pH7.0，装液量10％，接种量3％，发酵时间36h；最佳培养基组成为蔗糖12.0g/L+酵母膏12.0g/L+磷酸二氢钾1.25g/L+氯化钙0.22g/L+硫酸镁0.30g/L。在此条件下，发酵液活菌数达1.73×10¹⁰CFU.mL^-1。