[发明专利]采用饥饿发酵工艺生产基因治疗质粒的方法及发酵培养基

说明书

本发明公开一种采用饥饿发酵工艺生产基因治疗质粒的方法，包括以下步骤：(1)发酵罐准备：将一次性pH电极、一次性DO电极和冷却管路插入一次性罐体相应位置；发酵培养基配制好后将一次性罐体灭菌；完成发酵罐各管路的连接，设定温控系统(TCU)的温度并运行；(2)参数设置；(3)接种；(4)饥饿发酵控制。本发明的方法结合了饥饿发酵工艺和一次性全封闭式工艺，能够显著降低质粒产品中细菌宿主蛋白HCP残留含量。本发明还公开一种用于前述方法的发酵培养基，能够有效提高质粒发酵产量。

技术领域

本发明属于生物技术领域中用于基因治疗质粒的发酵方法，特别是涉及一种采用饥饿发酵工艺生产基因治疗质粒的方法及一种安全且高产的发酵培养基。

背景技术

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。基因治疗已成为很多重大疾病的有效治疗方法，在血友病、镰状细胞病、失明、多种严重的遗传性神经退行性疾病以及骨髓和淋巴结多发癌等疾病的治疗中均取得了重大进展(Gene therapy comes of age,2018,Science)。目前欧洲药品管理局(EMA)和美国食品药品管理局(FDA)已经批准6种基因治疗产品：2种用于B细胞癌的嵌合抗原受体T细胞产品(Car-T)和4种用于严重单基因疾病，如β-地中海贫血，一种罕见的视力丧失，脊髓性肌萎缩和罕见的原发性免疫缺陷(Gene therapy,2019,The New EnglandJournal of Medicine)。

基因治疗主要采用病毒和非病毒两种载体形式。从长远看，非病毒载体具有低免疫原型、低成本、易规模化等优点，因而具有更好的临床应用前景。而当前大部分细胞和基因治疗项目所采用的载体都为病毒载体。目前最为常用的病毒载体包括腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)、慢病毒(Lentivirus，LV)、腺病毒(Adenovirus，AdV)和逆转录病毒(Retrovirus，RV)等。这些病毒载体均可以通过包装质粒进行生产，因此，无论是从眼前看，还是从长远看，质粒DNA都是基因治疗的基础，而且需求量非常大。

质粒作为人用生物制品，对其生产与质量控制具有严格的要求。虽然已有专利(CN1914330B，2012；CN 101213294B，2013)建立大规模符合药学规格的质粒DNA发酵工艺，但均为传统发酵方法，未涉及一次性全封闭式生产工艺。一次性全封闭式生产工艺是基因治疗行业的发展趋势，工艺更加稳定可控，产品质量更加安全有效。

众所周知，通过细菌发酵及碱裂解法(A rapid alkaline extraction procedurefor screening recombinant plasmid DNA,1979,Nucleic Acids Res)可获得质粒。但目前的专利中(CN 1914330B，2012；CN 101213294B，2013；CN 103396975B，2016；CN108148831A，2018；CN 109337834A，2019)均未涉及饥饿发酵法生产质粒。以上发酵方法中存在质粒产品中HCP残留高的缺点且未考察如何降低HCP残留，例如专利CN 108148831A(2018)中宿主蛋白HCP残留为0.001μg/μg质粒DNA，折合为1000ng/mg，质粒产品中HCP残留高。现有文献中(Industrial Manufacturing of Plasmid-DNA Products for GeneVaccination and Therapy，2012)报道用于DNA疫苗的宿主蛋白残留量控制为＜1％，折后为10μg/mg，因此，生产的基因治疗质粒产品中HCP残留量应当符合该DNA疫苗的要求。现有文献中没有给出如何通过上游发酵工艺克服质粒产品的质量问题(如HCP残留)的指导。