[发明专利]一种雷氏普罗威登斯菌rtxD基因引物及荧光定量PCR检测方法和应用

说明书

本发明涉及一种雷氏普罗威登斯菌rtxD基因引物及荧光定量PCR检测，所述引物的核苷酸序列如下：RD‑F：SEQ NO.1；RD‑R：SEQ NO.2。本发明引物灵敏度高，特异性强，成本低廉，能够利用其快速检测雷氏普罗威登斯菌，如由雷氏普罗威登斯菌所导致的疾病，为雷氏普罗威登斯菌感染的早期诊断，减少雷氏普罗威登斯菌的危害，对人类、兽和鱼类的健康安全具有重要意义。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其是一种雷氏普罗威登斯菌rtxD基因引物及荧光定量PCR检测方法和应用。

背景技术

雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)属于肠杆菌科，普罗威登斯菌属。雷氏普罗威登斯菌广泛分布于土壤、水体等自然环境中。雷氏普罗威登斯菌不仅影响鱼、虾、龟鳖、鳄等水产动物健康养殖，而且对人类饮食构成潜在危害。目前认为雷氏普罗威登斯菌是条件致病菌，作为一种“人-兽-鱼”共患病病原菌，主要导致心包炎、尿道炎、腹泻等疾病。研究表明，人类感染雷氏普罗威登斯菌可引发腹泻、肺炎、尿道炎等多种疾病。近年来，雷氏普罗威登斯菌可以导致鱼、虾、鳖等多种水产动物发病死亡，且雷氏普罗威登斯菌对很多抗生素产生耐药，其产生的金属β-内酰胺酶可以水解所有的β-内酰胺类药物，造成细菌的多重耐药性，感染之后几乎无药可用，对人类和动物健康造成严重影响，已经受到广大研究者的关注和重视。但是，目前在人-兽-鱼疾病领域尚未有雷氏普罗威登斯菌荧光快速诊断技术。

由于雷氏普罗威登斯菌对人类生活造成严重危害，目前在人-兽-鱼疾病领域尚未有雷氏普罗威登斯菌荧光快速诊断技术，所以急需开发一种针对此菌的快速检测的手段。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种雷氏普罗威登斯菌rtxD基因引物及荧光定量PCR检测方法和应用，该引物灵敏度高，特异性强，成本低廉，能够利用其快速检测雷氏普罗威登斯菌，为雷氏普罗威登斯菌感染的早期诊断，减少雷氏普罗威登斯菌的危害，对人类和动物的健康安全具有重要意义。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌rtxD基因引物，所述引物的核苷酸序列如下：

RD-F：SEQ NO.1；

RD-R：SEQ NO.2。

一种利用如上所述的基因引物荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌的方法，步骤如下：

⑴提取待测细菌样品DNA；

⑵以步骤⑴中所提取的DNA为模板，采用荧光定量PCR方法扩增雷氏普罗威登斯菌rtxD基因，其中所使用引物的核苷酸序列为RD-F和RD-R，在58-61℃退火阶段根据荧光信号积累确定Cq值，在扩增条件后增加65℃至95℃，进行融解曲线分析；

⑶雷氏普罗威登斯菌的标准曲线的绘制：根据所选用的重组质粒作为模板，进行荧光定量扩增，绘制标准曲线；

⑷实验结果判定标准：若阴性对照品无Cq值，且无规则扩增曲线，同时Cq值应在15-35之间，扩增曲线规则，判断为阳性，并将所得Cq值在步骤⑶中所得标准曲线上确定样品中雷氏普罗威登斯菌的数量；反之，判断为阴性。

而且，所述步骤⑵中荧光定量PCR方法中使用的荧光染料为TB Green II。

而且，所述步骤⑶中重组质粒DNA的浓度为1.0×10³-1.0×10⁷拷贝/反应，绘制标准曲线，E＝99.1％，R²＝0.999。

而且，所述步骤⑵的具体步骤为：