[发明专利]一种敲除克雷伯氏菌Zn转运蛋白提高1,3-丙二醇产量的方法

说明书

本发明公开了一种敲除克雷伯氏菌Zn转运蛋白提高1,3‑丙二醇产量的方法，属于基因工程技术领域。本发明应用基因工程方法，将克雷伯氏菌来源的Zn转运蛋白基因ygiE进行敲除，从而降低其对Zn的转运能力，提高K.peneumoniae中1,3‑丙二醇的产量。重组菌经50mL摇瓶发酵，1,3‑丙二醇产量达20.34g/L。此发明成功改变了K.peneumoniae中对Zn的转运能力，可以减少培养基中盐离子的添加，同时可有效减少副产物，降低下游分离成本，提高1,3‑丙二醇产量，为选育1,3‑丙二醇高产菌株提供了崭新的思路。

技术领域

本发明涉及一种敲除克雷伯氏菌Zn转运蛋白提高1,3-丙二醇产量的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

1,3-丙二醇在纺织、塑料及食品包装等方面具有广阔应用前景。1,3-丙二醇的主要应用是作为聚合材料聚对苯二甲酸丙二醇酯(PPT)的合成单体，作为一种新型聚合材料，PTT具有很强的延展性，良好的抗污染、防紫外线能力，不易褪色，且容易被生物降解等优点，主要应用于高档地毯、纺织纤维。随着PTT市场的扩大，1,3-丙二醇的生产也极具前景。

目前，1,3-丙二醇的生产方法中化学合成法占据主导地位，但存在诸多缺点：高温、高压、催化剂昂贵、污染环境。生物法合成工艺相对简单，反应条件温和，生产过程更为环保。同时，随着生物柴油产业发展，产生大量废弃甘油。目前，天然菌株中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae，以下简称为K.peneumoniae)可利用甘油作为碳源生产1,3-丙二醇，同时克雷伯氏菌具有相对完善的遗传背景和基因工程改造工具。但在生产过程中存在1,3-丙二醇产量较低、甘油转化率低、副产物多等缺点。现代基因工程技术在定向改造菌株提高其生产1,3-丙二醇方面发挥重要作用，主要涉及弱化副产物合成途径、强化关键酶基因表达，虽然取得一定效果，但仍存在培养基中盐离子较多、副产物无法完全消除、酶活的提高未提高1,3-丙二醇产量等问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌是敲除了编码Zn转运蛋白的基因ygiE的克雷伯氏菌。

在本发明的一种实施方式中，所述Zn转运蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述ygiE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述敲除是利用CRISPR-Cas9的方法进行的

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的制备方法是将pCas9质粒、pTargetF-PMB1-N20质粒、donor修补模板，转化入克雷伯氏菌中，得到敲除编码Zn转运蛋白的基因ygiE的克雷伯氏菌。所述pTargetF-PMB1-N20质粒是以sgRNA-ygiE-up和sgRNA-ygiE-down为引物，以pTargetF-PMB1质粒为模板，进行PCR得到的；所述donor修补模板是以克雷伯氏菌基因组为模板，克隆ygiE基因上游500-1000bp和下游500-1000bp，再将ygiE基因上游500-1000bp和下游500-1000bp进行融合PCR得到的。

本发明的第二个目的是提供一种合成1,3-丙二醇的方法，所述方法是利用上述基因工程菌为生产菌株进行发酵培养。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是在35-39℃，120-180rpm下进行。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的时间为30-50h。