[发明专利]一种脐带间充质干细胞的分离方法

说明书

本发明公开了一种脐带间充质干细胞的分离方法：(1)取新鲜脐带，用PBS缓冲液冲洗干净，剪成小段，剥离组织，放于组织消化液中，将小段剪成组织块，加入氯化钙溶液，37℃消化45分钟，每隔15分钟取出吹打，混匀；(2)将含组织块的消化产物过筛进行过滤：过滤前先用无血清培养基浸湿网筛，过滤时将含组织块的消化产物逐渐滴加过滤，过滤后用无血清培养基冲洗网筛，得到比较充分的组织块和单细胞悬液；(3)将组织块和单细胞悬液离心，培养，得脐带间充质干细胞。第3天已经有很多细胞，7～8天，生长迅速，细胞处于对数生长期，细胞融合度能达到95～100％。后期进行成肌/成脂诱导分化，原代细胞分化程度很高，且细胞状态良好。

技术领域

本发明涉及一种脐带间充质干细胞的分离方法，属于细胞分离培养技术领域。

背景技术

间充质干细胞((Mesenchymal Stem Cells，MSCs)，起源于中胚层，是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，可在体外诱导分化为肌肉、脂肪、骨、神经等各种组织细胞。MSCs根据其本身的特点在血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、关节损伤修复、自身免疫疾病等方面有广阔的应用。随着技术和经济的发展，脐带间充质干细胞不仅在疾病方面有重大突破，在美容抗衰老行业也已经开始应用。人体的衰老实质上是细胞的衰老，补充间充质干细胞，让其在体内更新代谢，可以抑制衰老的过程。

目前MSCs在临床上的应用主要来源于骨髓和脐带。成年人骨髓中的MSCs量少，取材痛苦复杂，还要注意感染的风险，相比而言，脐带来源丰富，采集简单，对母亲和新生儿无任何不良影响，MSCs数量多，增殖能力强，基因稳定，免疫原性低，具有免疫调节功能，对供着无排斥反应。

现有技术中，脐带间充质细胞分离的主要方法有酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法一般采用的是先后用胰酶和Ⅰ型胶原酶等体积加入过夜消化脐带组织，将离心弃上清后产物直接接种于培养瓶中。其弊端是：消化时间过长，可能会影响细胞活性，而且消化时间过长酶可能将一些其它细胞消化完全，导致铺板细胞纯度偏低。组织块贴壁法是将新鲜脐带清洗干净，用手术剪将其剪成2～3mm³的小块，放到被包被过的培养皿中，添加培养基，不断换液，一般需要14～20天细胞密度才可达到传代水平。该方法操作简便，经济成本低，其弊端是：组织块没有去除表皮和血管内皮等细胞，导致获得分离培养的原代间充质干细胞培养周期长，而且直接将组织块贴壁培养，待细胞密度达到传代水平就将脐带组织弃掉，未充分利用脐带组织。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的分离方法，本发明利用胶原酶消化法，优化脐带间充质干细胞的分离方法，提高了分离效率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种脐带间充质干细胞的分离方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜脐带，用PBS缓冲液冲洗干净，剪成(用手术剪)小段，剥离组织，放于组织消化液中，将小段剪成1mm³的组织块，加入终浓度至0.36mM的氯化钙溶液(激活酶充分发挥作用)，37℃消化45分钟(置于37℃恒温空气浴摇床中)，消化期间每隔15分钟取出吹打，混匀；

所述组织消化液，由Ⅳ型胶原酶和无血清培养基组成，其中，Ⅳ型胶原酶的浓度为1mg·mL^-1；

(2)消化结束后，将含组织块的消化产物依次过8目筛、10目筛进行过滤：过滤前先用无血清培养基(1mL)浸湿网筛，过滤时将含组织块的消化产物逐渐滴加过滤，过滤后用无血清培养基(2～3mL)冲洗网筛，得到比较充分的组织块和单细胞悬液；

(3)将组织块和单细胞悬液离心，培养(0.5～1.5个组织块/cm²密度接种到75cm²培养瓶)，得脐带间充质干细胞，显微镜下观察，第3天已经有很多细胞，7～8天时细胞很多，生长迅速，且状态很好。