[发明专利]基于实时荧光定量PCR技术检测人乳头瘤病毒的引物、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明基于实时荧光PCR技术提供一种检测人乳头瘤病毒的引物、探针、试剂盒及方法。其中，引物包括正向引物和逆向引物，如SEQ ID NO:1～28所示；探针：SEQ ID NO:29～42所示；QPCR模板如SEQ ID NO:43～56所示。本发明通过对NCBI数据库中14种高风险亚型HPV所有分离株的基因组DNA做同源性比对，选择出每种亚型高度保守的序列设计出正逆向引物以及探针，能够敏感、准确地检测出高风险型HPV每个亚型所有分离株的基因组DNA，且能进行准确分型，特别适用于生物制品，尤其是细胞中HPV污染的分型检测。

技术领域

本发明所属生物检测领域，特别是涉及一种利用实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种无包膜包裹的双链闭环小DNA病毒，属于多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，具有普遍传染性，易引发妇女宫颈癌。目前，每年约有20万妇女死于该种疾病，且年轻化趋势越发明显，从而引发社会各界普遍关注。依据WHO国际癌症研究机构以及其他研究机构研究成果，将与宫颈癌发生有关的HPV亚型分为三种类型，分别为高风险型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82)、假定的高风险型(HPV26、53、66)以及低风险型(HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81)。持续感染高风险型HPV被视为引发宫颈癌的必要原因，因此生物制品中高风险型HPV的污染会给患者带来严重的健康风险。为减少HPV污染，各国药品管理法规都要求人源细胞用于生物制品的生产时必须进行HPV病毒的检测。生物制药公司非常需要一种具有良好专一性、灵敏性并能涵盖14种高风险型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测方法。

目前HPV的检测方法主要包括HPV细胞学检测、HPV蛋白检测、HPV DNA检测以及HPV感染的血清学检测。其中用PCR检测HPV DNA的方法因其灵敏准确，是理想的检测生物制品污染的方法。目前商业化的HPV PCR检测试剂/试剂盒主要用于临床检测，检材为微量人体宫颈组织，主要用于宫颈癌筛查。为了减少宫颈癌筛查的假阳性，这些检测方法的灵敏度都不高，大约在1000个HPV基因组DNA拷贝的水平，且基本没有验证过大量细胞DNA是否会干扰检测。

不仅如此，目前文献报道的HPV病毒检测方法大多不能完全涵盖14种高危亚型，或能涵盖但不能完全区分这些亚型，且没有任何一个方法能够保证检测到这些亚型中的每一个分离株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种能涵盖且能完全区分14种高危亚型的检测HPV的qPCR检测方法，其能够区分14种高风险型HPV，具有良好专一性、灵敏性以及变异株高度覆盖性等优点。

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的引物组合，包括：

HPV 16正向引物：TGACACAGAAAATGCTAGTGCT(如SEQ ID NO:1所示)，

HPV 16逆向引物：TCACCTGGATTTACTGCAACAT(如SEQ ID NO:2所示)；

HPV 18正向引物：AATGTCTGCAGATCCTTATGGG(如SEQ ID NO:3所示)，

HPV 18逆向引物：CTTGGAGAGGGAGAATACACAC(如SEQ ID NO:4所示)；

HPV 31正向引物：GACCGTTGTGTCCAGAAGAA(如SEQ ID NO:5所示)，

HPV 31逆向引物：ACGCATGTTTACACTTGGGT(如SEQ ID NO:6所示)；