[发明专利]基于转录组的椴树属EST-SSR引物及其筛选方法和应用

说明书

本发明公开了一套基于南京椴全长转录组序列开发的EST‑SSR分子标记，涉及引物共27对，其核酸序列如序列表SEQ ID NO.1~54所示。本发明的27对EST‑SSR标记是基于转录组序列筛选候选SSR位点并设计的SSR扩增引物，并通过该属不同物种为材料，选用基因组DNA进行扩增验证为明确的SSR标记，具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、共显性且易于检测等优点。本组标记填补了椴树属共显标记的空白，为本属植物种类鉴定、遗传谱系分析、种质资源的保护和辅助育种等领域，能够极大的促进椴树属资源的研究及开发应用。

技术领域

本发明涉及一种基于转录组的椴树属EST-SSR引物及其筛选方法和应用，属于分子标记技术开发及应用技术领域。

背景技术

椴树属(Tilia L.)，落叶乔木，是锦葵科(Malvaceae)一个形态特殊且唯一北半球分布属，为北温带落叶至常绿阔叶林中的特征和优势属植物之一，物种多样性中心位于我国。该属植物在世界范围内栽培历史十分悠久，兼具材用、纤维用、药用、景观及蜜源等功能，开发应用前景十分广泛。

椴树属植物特征明显，花序和果序上具有叶状独特的大型苞片，易于与其他类群区别。最新研究将全球椴树属植物共划分为23种，北美2种，欧洲至西亚4种，东亚17种，包括中国特有种15个。但属内种间缺乏生殖隔离，种质渗入现象较为普遍，近缘类群种间形态性状变异和交叉现象并未很好的解释，椴树属种间关系和演化历史仍不清楚。仅依靠叶绿体系统发育基因组学的手段很难完全解决其系统发育问题，因此从核基因入手，获得较多的信息位点，将为全面的解释椴树属物种的演化提供依据。长久以来，椴树属植物中缺乏高效的、可靠的、稳定的、共显性的核基因SSR标记。利用SSR标记不仅有助于揭示椴树属系统发育问题，而且有助于该属植物资源多样性分析及分子标记辅助育种工作的推进，对今后椴树属植物资源高效利用和开发具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种基于转录组的椴树属EST-SSR引物及其筛选方法和应用。提供的椴树属特异性SSR分子标记可利用到属内物种分类及进化研究、资源遗传多样性分析、核心种质的构建及辅助育种等工作中，填补了椴树属共显性SSR标记的空白。

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于转录组的椴树属EST-SSR引物，所述引物共27对，所述引物序列如SEQ ID NO.1～54所示。

上述椴树属植物可为椴树属中的以下种类中的任意一种或几种，但不限于以下几种，可推广应用至本属23种：南京椴(Tilia miqueliana Maxim.)、南京椴(黄叶)、糯米椴(Tilia henryana Szyszyl.)、银毛椴(Tilia tomentosa Moench)、紫椴(Tilia amurensisRupr.)、糠椴(Tilia mandshurica Maxim.)、欧洲小叶椴(Tilia cordata Mill.)。

本发明还提供一种基于转录组的椴树属EST-SSR引物的筛选方法，包括：

构建转录组文库：分别提取南京椴根、茎、叶、花和苞片5个组织的RNA，并等量混合后，反转录合成全长cDNA，构建不同大小的cDNA文库，经质控后，使用PacBio RSII平台进行测序，获得全长非嵌合序列；

对全长非嵌合序列进行聚类分析，校正后获得高质量转录本序列，经去冗余分析得到高质量去冗余转录本序列；

采用MISA软件对南京椴转录组数据中的高质量去冗余转录本序列进行单碱基重复SSR、双碱基重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复SSR和混合SSR位点搜索；

采用Primer3软件进行SSR引物设计，引物序列长度18-27bp，预计扩增产物长度100-280bp，GC含量40％-60％，退火温度57-63℃，上、下游引物的退火温度值相差不大于2℃；