[发明专利]一种RNA放大检测方法及检测试剂盒

权利要求书

1.一种RNA放大检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将含有待测样品RNA、引物、探针、荧光探针和相关聚合酶的反应物混合为反应混合物；

2)将反应混合物置于密闭容器中进行恒温放大反应，并用检测仪同步检测反应体系中荧光信号的变化，定量或定性检测待测样品RNA。

2.根据权利要求1所述的RNA放大检测方法，其特征在于：所述反应混合物包含以下组分：

a.待测样品RNA；

b.第一引物：所述第一引物的序列包含启动子序列和共同引物序列，其中所述共同引物序列为与所述待测样品RNA非同源的序列；可选的，所述启动子序列为T7启动子序列；可选的，所述第一引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示；

c.探针A：所述探针A的3’端序列为与待测样品RNA特异性结合的序列，5’端序列为所述第一引物的序列；

d.探针B：作为第二引物，其序列与所述待测样品RNA序列一致；

e.荧光探针，用于与所述恒温放大反应产物结合；

f.逆转录酶；和

g.识别所述启动子序列的RNA聚合酶；

优选的，还包含：

h.含有特异性捕获探针的固相支持物，所述特异性捕获探针用于捕获待测样品RNA。

3.根据权利要求2所述的RNA放大检测方法，其特征在于，所述待测样品RNA的获得方法包括以下步骤：

11)RNA试样制备；

12)向所述RNA试样中添加核酸提取液，混匀后进行提取，获得待测样品RNA；其中所述核酸提取液包含探针A和含有特异性捕获探针的固相支持物，所述探针A用于与所述待测样品RNA特异性结合，以引入第一引物序列；

具体地，步骤12)中所述固相支持物为磁性颗粒，所述提取的流程具体为：

121)向所述RNA试样中添加所述核酸提取液，混匀后在55-95℃下孵育8-12min，室温静置至提取液混合物恢复到室温，磁力架上吸磁至少1min，弃上清；

122)加入洗涤液(HEPES 10mM，NaCl 50mM，1％SDS，EDTA 5mM)重悬磁性颗粒，磁力架上吸磁1-3min，弃上清；

123)重复步骤122)，获得待测样品RNA。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的RNA放大检测方法，其特征在于，步骤1)中所述反应混合物的获得方法具体包括以下步骤：

T1)第一步反应混合：向所述待测样品RNA中加入第一步反应液和酶液进行反应，获得第一步反应产物，其中所述第一步反应液包含第二引物，所述酶液中含有逆转录酶和识别所述启动子序列的RNA聚合酶；优选第一步反应条件为：37-45℃下反应3-10min；

T2)第二步反应混合：向所述第一步反应产物中加入第二步反应液，获得反应混合物，其中所述第二步反应液包含第一引物和荧光探针。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的RNA放大检测方法，其特征在于，步骤2)中所述恒温放大反应的条件为：37-45℃下反应20-60min。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的RNA放大检测方法，其特征在于，所述第一步反应液的组分为：10-50mM Tris，20-90mM KCl，10-50mM MgCl₂，0.1-10mM NTPS，0.1-10mMdNTPs，5-40％甘油，0-25％DMSO，0.01-2μM第二引物；

所述第二步反应液的组分为：10-50mM Tris，20-90mM KCl，10-50mM MgCl₂，0.1-10mMNTPS，0.1-10mM dNTPs，5-40％甘油，0-25％DMSO，0.01-2μM第一引物，0.01-2μM荧光探针；

所述酶液的组分为：100-9000U逆转录酶，100-5000U RNA聚合酶，20-100mM Tris，0.1-1％TritonX-100，30-300mM KCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-2mM DTT，20-50％甘油；

优选地，所述第一步反应液、酶液与所述第二步反应液的用量体积比为(2-3)：(1-2)：(2-3)。