[发明专利]表面功能化纳米纤维细菌检测膜及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种表面功能化纳米纤维细菌检测膜及其制备方法和应用，属于生物化学技术领域。该表面功能化纳米纤维细菌检测膜为表面接枝有显色底物的功能化纳米纤维细菌检测膜，首先制备一种聚乙烯醇‑乙烯共聚物纳米纤维膜，对其进行表面功能化处理，然后在其表面接枝能够与细菌中的特异性酶发生酶促反应的显色底物，得到表面功能化纳米纤维细菌检测膜。将本发明制备的细菌检测膜浸泡在细菌悬浮液中，显色底物在细菌中的特异性酶的作用下发生酶促反应，解离出显色物质，通过测试细菌检测膜表面或溶液的荧光强度或吸光度或者颜色深度变化，实现对细菌浓度的可视化、快速、可靠和特异性的灵敏检测。

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种表面功能化纳米纤维细菌检测膜及其制备方法和应用。

背景技术

细菌等微生物感染已严重威胁到了人类的生命安全，由细菌感染引发的疾病造成的死亡的人数已达全球总死亡人数的三分之一。因此，为了减少食源性和水源性细菌病原体的爆发，细菌等病原体的较早和精确检测显得尤为重要。然而，目前有害细菌的标准分析方法，例如传统的平板计数和聚合酶链反应(PCR)，是从样品中提取并培养细菌，再检测细菌的结构形态及代谢产物，实现对细菌的定性定量识别，方法特异、结果准确，但这些方法需要繁琐的样品准备和复杂的检测过程、耗费时间长，需要先进的仪器设备和专业的实验操作人员，不能满足临床和实际生活中对细菌浓度实时检测的需要。因此，开发快速、灵敏、高效的细菌实时检测方法，对于临床诊断和治疗、水质监测和食品安全检测等领域具有重要的意义。

比色法是一种不依赖于先进仪器设备和专业实验操作人员的一种快速的细菌检测的方法，其中基于酶促响应的比色法因其实用性和检测专一性的优点，被广泛应用。酶促比色法检测细菌是基于底物在酶的作用下，通过生物化学反应产生颜色变化，通过颜色变化确定细菌浓度的范围。但是此种方法确定的细菌浓度精确度较低，而且细菌浓度过大时，还需要进一步稀释确定其浓度范围。为了解决目前细菌检测的局限，细菌的试纸化检测成为最有效便捷的检测方法之一。

例如申请号为CN201810178510.6的发明专利公开了一种荧光型细菌检测膜和制备方法及其细菌检测的方法，该细菌检测膜包括基材层及设置在基材层上的检测层，基材层由功能化细菌检测膜组成，检测层由功能性阳离子聚合物和阴离子聚合物通过层层自组装的方式均匀交替组装设置在功能化细菌检测膜表面。利用细菌表面丰富的负电荷，在细菌存在的环境下，细菌会优先和膜表面的正电性聚合物相结合，从而破坏细菌检测层的完整性，并且细菌检测层的被破坏速度与细菌浓度成正比。该发明中因为正电性聚合物中含有荧光分子，因此，可以通过测定膜表面的荧光强度来探测膜表面细菌检测层被破坏的程度，进而确定细菌浓度。然而，此种方法通过静电吸附将含有荧光分子的正电性聚合物吸附在膜表面，又利用细菌的负电性进行监测，由于静电吸附作用力的稳定性低，易受到其他负电性强的物质的干扰，因此细菌浓度检测的可靠性较低。申请号为CN201810178518.2的专利公开了一种大肠杆菌检测膜和制备方法及其细菌检测的方法，糖基聚合物和苯硼酸聚合物通过层层自组装设置在纤维膜表面，其稳定性受溶液pH值及外界离子强度的影响较大，外界pH值及离子强度的变化，尤其是临近临界阈值的微小变化即可对检测结果带来较大干扰。申请号为CN201810178378.9的专利公开了一种接枝共聚制备大肠杆菌检测膜及细菌检测的方法，通过原子转移自由基聚合在纳米纤维膜表面接枝引入甘露糖聚合物，然后再与异硫氰酸荧光素功能化牛血清蛋白复合，制备得到大肠杆菌检测膜。在高蛋白含量环境中，检测物中的蛋白质会将异硫氰酸荧光素功能化牛血清蛋白从检测膜中置换至溶液中，从而导致检测结果的假阳性。Ebrahimi等希望在壳聚糖水凝胶表面接枝显色底物，通过测试荧光强度或吸光度值，实现大肠杆菌的浓度检测(ACS Applied materialsInterfaces，2015，7，20190-20199)。但该方法制备的水凝胶对大肠杆菌的响应时间较长，浸泡时间为100min左右，荧光强度或吸光度值才发生明显变化，而且水凝胶存在强度较低、容易被破坏的问题，在大肠杆菌悬浮液的作用下易吸水膨胀，对检测精度造成干扰。并且最终并未建立细菌浓度与荧光强度或吸光度值直接的定量相关性，未建立细菌浓度与细菌检测膜膜表面颜色的定量或定性关系，并未实现通过观察膜表面颜色的变化达到对细菌可视化检测的效果。