[发明专利]一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法

权利要求书

1.一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，测序数据过滤步骤：

首先使用fastp软件去除测序结果中的接头和低质量序列：

所述fastp软件使用PE reads overlap信息自动识别接头序列，同时以5个碱基长度为窗口，从3’端向5’端滑动，截去窗口内平均质量小于20的窗口，最后保留长度大于50的reads；

接着将去除接头和低质量序列后的测序数据采用fastqc软件进行质量控制：

所述质量控制为根据RNASeq的测序特点提供质量控制标准；

步骤二，测序数据比对步骤：

使用hisat2软件将过滤后的数据与参考基因组进行比对：

首先从基因组数据库中下载对应物种的参考基因组，下载下来的基因组序列使用hisat2-build构建索引；

对于构建索引后的序列进行比对；

将比对完成的测序数据通过RSeQC进行质量控制；

步骤三，转录拼接步骤：

使用stringtie进行转录拼接，重构样品的转录本序列；

首先需要对每个样品单独使用stringtie拼接，然后使用stringtie merge将所有样品的转录本进行合并；合并后的转录本为最后重构出来的转录本序列；

步骤四，基因比对步骤：

重构的转录本序列与参考基因组注释进行对比：

区分mRNA，已知lncRNA和新发现的lncRNA；

步骤五，lncRNA过滤步骤：

对新发现的lncRNA进行过滤，然后进行编码潜能预测，去除有编码潜能的结果；

对于新发现的lncRNA首先需要去除；

剩下的lncRNA使用PFAM、PELK和CNCI预测编码潜能，只有在3个软件中都预测为noncoding的序列才保留下来；

步骤六，lncRNA分析步骤：

使用stringtie对转录本进行表达定量，然后用DESeq进行差异分析，对差异表达的lncRNA的顺式和反式靶基因进行预测和功能富集分析。

2.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述质量控制标准为：

所述测序数据的碱基分布的四条线为：AT平行且接近或GC平行且接近或GC整体分布应该近似于正态分布或不能出现多峰；

测序数据的Duplicate水平与建库的PCR循环数一致。

3.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述基因组数据库包括Ensembl或和NCBI。

4.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，构件索引为在hisat2比对时加上链特异性参数，所述链特异性参数当中，当采用dUTP建库方法时，对应的参数为--rna-strandness FR，其他方法当中参数采用默认值。

5.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述步骤二当中的比对为：

模式生物的比对率为不低于80%，多重比对率为不高于10%；如果比对率低，需要检查测序样品是否有污染；如果多重比对率高，需要检查测序数据的核糖体比例。

6.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，对于RSeQC质量控制具体为：

对于RSeQC的结果在基因区间上采用reads分布，比对结果的链信息与建库方式对应，dUTP建库的测序数据需要集中在‘1+-,1-+,2++,2--’上，使得Reads在基因结构上需要呈现出中间高，两端低的分布形状。

7.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述区分mRNA为：

使用gffcompare将重构的转录本与参考的基因组信息进行对比，根据对比结果的标签判断转录本的类型：“=”和“c”为已知转录本，“j”、“e”、“o”、“m”、“n”和“k”为已知基因的新转录本，“x”、“i”和“u”为新发现的转录本。