[发明专利]L-阿拉伯糖差向异构酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及一种L‑阿拉伯糖差向异构酶突变体，及其在微生物催化D‑半乳糖异构化制备D‑塔格糖中的应用。所述L‑阿拉伯糖差向异构酶突变体，由所示氨基酸经定点突变而得，所述点突变位点为下列中的一个或多个：(1)第97位、(2)第189位、(3)第301位、(4)第409位和(5)第462位。本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种全新的差向异构酶及其突变体，以及其在制备塔格糖(D‑tagatose)中的应用。该突变体具有高最适反应温度80℃，解决了现有酶无法在高温生产D‑tagatose的技术难题。使用本突变体生产D‑tagatose，底物浓度为600g/L时，产物得率最高可达79.7％，优于原始酶和其他突变酶的转化效果，具有较好工业应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种L-阿拉伯糖差向异构酶突变体，及其在微生物催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

(二)背景技术

D-塔格糖(D-tagatose)是自然界中发现的稀有己酮糖，是D-半乳糖的异构体。它最早被发现存在于一种热带长青植物的树胶中，后来在酸奶、奶酪中也有发现。D-tagatose具有甜度高、热量低、吸收率低、有效降低血糖及抗龋齿、改善肠道菌群等性质与功效。美国食品及药物管理局已通过对D-tagatose的安全认证，准许其用于食品中。D-tagatose的生产方法主要有化学法和生物法。化学法存在成本高、酸碱用量高、污染严重、产物成分复杂、分离纯化难等问题。相比之下，生物法制备D-tagatose更具有优势，近年来逐渐成为研究热点。

生物法制备D-tagatose的工艺是以D-半乳糖为原料，利用L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase，简称LAI)进行催化反应，一步法生成D-tagatose。其中，原料D-半乳糖廉价易得、整体反应过程温和易控、反应过程符合环保要求，是一种替代化学法的最优制糖方法。研究报道指出，高温和弱酸性的反应条件更有利于D-tagatose的生物转化。当前，生物法催化D-半乳糖制备D-tagatose时底物浓度偏低，均处于100g/L以下，不利于应用到工业化生产中。当前，LAI制备D-tagatose存在的问题是酶源少，催化效率有待提高。

由于异构酶本身作用环境和对象的多样化，通常具备底物谱广泛的优势，可以由一种异构酶催化制备多种糖产品，这为研制针对特定糖的异构酶催化剂提供了新的途径。以核酸、蛋白质等生物大分子数据库为主要对象，辅助计算机对生物信息进行比较分析，获取基因编码、蛋白质结构功能及其相互关系等理性信息，筛选新型异构酶制剂，探索异构酶的底物谱，开发异构酶的新功能，将分子改造获得的高效生物催化剂用于制备高浓度D-psicose，对于满足人民群众日益增长的摄糖需求具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种最适反应温度高且收率高的L-阿拉伯糖异构酶异构体突变体，及其在微生物催化D-半乳糖异构化制备D-塔格糖中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种L-阿拉伯糖差向异构酶突变体，由序列如SEQ ID NO.5所示氨基经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或多个：(1)第97位、(2)第189位、(3)第301位、(4)第409位、(5)第462位。

优选的，所述突变体由序列如SEQ ID NO.5所示氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第97位甘氨酸G突变为天冬酰胺N、精氨酸R、赖氨酸K、天冬氨酸D或半胱氨酸C，(2)第189位天冬氨酸N突变为丝氨酸S、谷氨酰胺Q、甘氨酸G或组氨酸H，(3)第301位亮氨酸L突变为异亮氨酸I、蛋氨酸M或谷氨酸E，(4)第409位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F、脯氨酸P或丝氨酸S，(5)第462位苏氨酸T突变为丙氨酸A、色氨酸W或酪氨酸Y。