[发明专利]一种滋养细胞及其制备方法和在NK细胞扩增中的应用

说明书

本发明提供一种滋养细胞及其制备方法和在NK细胞扩增中的应用。一种滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：（1）构建MBIL21的序列及构建表达MBIL21的显示绿色荧光的慢病毒质粒；（2）构建用T2A连接的CD86和CD137L的序列和带有嘌呤霉素抗性的慢病毒质粒；（3）将步骤（2）获得的慢病毒质粒进行包装，提取慢病毒感染k562细胞，逐渐增加嘌呤抗性的浓度，筛选出具有抗性的k562‑CD86‑CD137L细胞，并采用低浓度嘌呤霉素维持培养；（4）将步骤（1）获得的慢病毒质粒进行包装，提取慢病毒感染步骤（3）得到的k562‑CD86‑CD137L细胞，用流式分选仪分选出具有绿色荧光标志的细胞，k562‑CD86‑CD137L‑MBIL21细胞，即为该滋养细胞。本发明从外周血单个核细胞中直接扩增NK细胞，便于操作，为研究原代NK细胞提供了基础。

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种滋养细胞及其制备方法和在NK细胞扩增中的应用。

背景技术

NK细胞（natural killer cell，自然杀伤细胞）是兼具细胞毒性和免疫调节功能的先天免疫系统的重要细胞，对多种人类恶性肿瘤具有治疗潜力。但是，由于NK细胞在体外扩增不良，在体内的寿命有限，并且仅占外周血单核细胞（PBMC）的5-20％，因此获得足够的细胞数量是NK细胞免疫疗法的主要障碍。

NK细胞可以通过增殖性细胞因子（例如IL-2和IL-15）活化而扩增。NK细胞的扩增可以通过滋养细胞（例如肿瘤细胞系或PBMC）中的蛋白质大大增强。因此，构建辐照的滋养细胞和NK细胞的共培养系统能够生成大量NK细胞。

应用基因工程细胞（Gene engineering cells, GEC）作为滋养细胞进行NK细胞体外扩增是一种重要的NK细胞扩增新策略。在以往的研究中有研究者应用CD64、CD86修饰K562细胞构建人工抗原递呈细胞（Antigen present cell, aAPC），然后将4-1BBL（CD137L）和膜固定IL15（membrane-bound IL-15，mlL-15）等导入此细胞中，构建CD64-CD86-4-1BBL-m1L15-aAPC，并利用此人工抗原递呈细胞进行NK细胞体外扩增，这种方法可以获得较强细胞毒性的NK细胞，但NK细胞增殖受到限制，5-6周后细胞不再扩增。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种滋养细胞及其制备方法和在NK细胞扩增中的应用。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建MBIL21的序列及构建表达MBIL21的显示绿色荧光的慢病毒质粒；

（2）构建用T2A连接的CD86和CD137L的序列和带有嘌呤霉素抗性的慢病毒质粒；

（3）将步骤（2）获得的慢病毒质粒进行包装，提取慢病毒感染k562细胞，逐渐增加嘌呤抗性的浓度，筛选出具有抗性的k562-CD86-CD137L细胞，并采用低浓度嘌呤霉素维持培养；

（4）将步骤（1）获得的慢病毒质粒进行包装，提取慢病毒感染步骤（3）得到的k562-CD86-CD137L细胞，用流式分选仪分选出具有绿色荧光标志的细胞，k562-CD86-CD137L-MBIL21细胞，即为该滋养细胞。

如上述的滋养细胞的制备方法制备的滋养细胞。

如上述的滋养细胞在NK细胞扩增中的应用。

利用上述的滋养细胞扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：

（1）致死性照射或丝裂霉素处理该滋养细胞，并将处理后的滋养细胞与外周血单核细胞混合，在NK细胞扩增培养液中共培育；

（2）每周重复刺激1次，连续数周，以获得足够量的NK细胞。