[发明专利]Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒及制备方法及组合型偶联剂

说明书

本发明公开了一种Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒及其制备方法及其专用组合型偶联剂，所述的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒为通过组合型偶联剂，将Ⅳ型胶原蛋白抗体交联于羧基胶乳微球上，形成Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒；所述的组合型偶联剂包括有以下组分:碳二亚胺、O‑苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲四氟硼酸和O‑苯并三氮唑‑四甲基脲六氟磷酸盐三者质量比为1.2﹕1.2﹕1。本发明优点在于：显著提高了抗体与胶乳微球间偶联的合成反应活性、偶联效率、和偶联的稳定性，提高了抗体利用率。

技术领域

本发明属于医学检测及体外诊断领域，具体是指一种Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒及制备方法及组合型偶联剂。

背景技术

IV型胶原蛋白(IVC)属于非原纤维胶原蛋白，是基底膜网状结构的主要成分之一，不但在BMs骨架形成过程中起重要作用，而且还具有参与细胞黏附、迁移、生长、增殖和分化等重要生理过程的功能，因此，IV型胶原蛋白(IVC)的生物学特性与肿瘤、肾病等多种重大疾病密切相关。

作为肝细胞基底膜的核心结构，在肝纤维化形成过程中起主要作用。Ⅳ型胶原蛋白在肝纤维化时有显著变化，在轻度肝损伤合并肝纤维化内胶原总量增加尚不明显时，血清Ⅳ型胶原蛋白含量即可明显增加，其含量的变化能较好的反应肝纤维化、肝细胞损伤及程度。

目前市场上IV型胶原蛋白(IVC)检测技术常用的方法有如下几种：酶联免疫检测法(ELISA)、放射免疫分析法、时间分辨荧光免疫分析方法、胶乳免疫比浊法、化学发光法等。其中酶联免疫检测法(ELISA)需要特定设备，耗时；放射免疫分析技术法需要搭配昂贵的设备，存在放射线辐射和污染等问题；时间分辨荧光免疫分析方法需要用稀有金属进行标记；化学发光法需要特定设备，且仅能一次发光且易受环境干扰。胶乳免疫比浊法属于普通免疫比浊技术的衍生技术，克服了普通免疫比浊技术信号量非常有限的缺点，使抗体体积有了数量级上的增长，大幅提升了可检测性，但该方法也存在技术难点，即抗体与胶乳微球的偶联效率无法保证，易出现偶联不上、偶联速度慢及后期脱落等情况，使得其活性及稳定性不能保证。

大部分的抗体与胶乳微球偶联所使用的偶联剂以碳二亚胺(EDC)为主，合成反应活性、偶联效率、和偶联的稳定性不能得到保证，因此，找到一种抗体与胶乳微球间高效偶联的偶联剂，是本领域亟需解决的技术问题。

发明内容

为解决现有技术存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒及制备方法及组合型偶联剂。本发明技术方案运用组合型偶联剂，将Ⅳ型胶原蛋白抗体交联于羧基胶乳微球上，形成Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒，实现抗体与胶乳微球的高效偶联。

为实现上述目的，本发明的第一个方面是提供一种Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒制备方法，其技术方案是所述的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒为通过组合型偶联剂，将Ⅳ型胶原蛋白抗体交联于羧基胶乳微球上，形成Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒；

所述的组合型偶联剂包括有以下组分:

碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐三者质量比为1.2﹕1.2﹕1。

进一步设置是包括以下步骤：

(1.1)用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液悬浮10％(w/v)且粒径100-200nm羧基胶乳微球，室温搅拌30min混合均匀，10000rpm转速下离心15min，去除上清液后用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌30min混合均匀，使其质量体积浓度为2％；

(1.2)取上述悬浮微球，边室温搅拌，边加入组合偶联剂；该组合偶联剂的成分为碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐；