[发明专利]一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺

权利要求书

1.一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，包括以下步骤：

S1：制备发酵培养基：包括以下含量的原料配比：葡萄糖3g/l，酵母膏1g/l，MgSO₄0.05g/l，尿素0.1g/l，KH₂PO₄ 0.05g/l，K₂HPO₄ 0.05g/l，添加物L-半胱氨酸4g/L，L-谷氨酸3g/L，苯丙氨酸3g/L，VBr-HC1 0.5g/L，烟酸0.5g/L，肌醇1g/L；

S2：在培养基中测定3-氰基吡啶水合酶活力:定量吸取培养液离心，取细胞并悬浮于2.5mol/L的磷酸缓冲液中，加入2.5ml、0.4mol/L的3-氰基吡啶，混匀，于25℃振荡反应20分钟，以0.1ml、3mo1/L HCl终止反应，离心后用HPLC法测定反应清液中烟酰胺的生成量；

S3：测定培养基中的生物量：在721分光光度计460nm处、1.0cm光径测定稀释20倍的细胞培养液的生物量，再以同样稀释度的培养基为对照，并校正为干细胞重；

S4：烟酰胺的生物催化：将筛选、优化后的马红球菌接入发酵罐进行发酵培养，得到含3-氰基吡啶水合酶的发酵液，并将发酵液在一定的低温下离心得细胞体，再将细胞体用蒸馏水配成一定浓度的悬浮液，在一定的温度下，分批加入底物烟腈，分批催化转化，并用HPLC测烟腈、烟酰胺的含量，当底物烟腈浓度低于0.1％时终止酶催化转化，转化液经高速离心去掉细胞体，得含烟酰胺溶液，再在一定温度下加入一定量的活性碳脱色，过滤，再浓缩后得含烟酰胺的浓缩液，再在一定的低温下冷却结晶得湿烟酰胺。

2.如权利要求1所述的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，S2中磷酸缓冲液的pH＝7.5。

3.如权利要求1所述的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，在S2的反应条件下，1分钟内催化水合3-氰基吡啶生成1.0μmol烟酰胺所需的酶量定义为3-氰基吡啶水合酶的一个活力单位U。

4.如权利要求1所述的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，S2中烟酰胺水解酶活力:除以0.4mol/L烟酰胺溶液作底物及测定烟酸生成量外，其他测定条件同3-氰基吡啶水合酶活力的测定，在1分钟内催化水解烟酰胺生成1.0μmol烟酸所需的酶量定义为烟酰胺水解酶的一个活力单位。

5.如权利要求1所述的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，S4中为了能够更好的使含烟腈水合酶转化烟腈生产烟酰胺，还提供如下步骤：

S401：先离心得固定化细胞，再将细胞体用蒸馏水配成一定浓度的细胞悬浮液，按比例加入一定量的海藻酸钠，经搅拌混匀后得粘稠状液体；

S402：用注射器将粘稠状液体注入含一定量的CaCl₂水溶液中得小球状的固定化细胞颗粒，将细胞颗粒在一定的低温下硬化10多小时，过滤后得生产用的能转化底物烟腈的固定化细胞；

S403：在10℃温度下，往含固定化细胞的液体中分批加入底物烟腈，固定化细胞将烟腈生物催化成烟酰胺；

S404：用HPLC法测烟腈、烟酰胺的含量，当烟腈含量低于0.1％时终止生物催化，将转化液过滤后得含烟酰胺溶液，再经冷却结晶得湿烟酰胺。

6.如权利要求1所述的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，S4中湿烟酰胺具体提取方法为：将转化液放入烧杯中，外加冰浴锅冷却，开启搅拌并缓慢冷却，当温度降到12-13℃时加入适量晶种并继续缓慢冷却，温度逐渐降到-3℃时，溶液慢慢变混浊直至析出大量晶体使溶液变得粘稠，中途析出大量烟酰胺可先过滤得湿烟酰胺，母液进一步冷却结晶，随后停止搅拌，过滤得滤饼，将滤饼放烘箱于85℃烘干即可得成品。