[发明专利]一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法

权利要求书

1.一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）种子液制备：以巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）为出发菌株，经过活化后接种于种子培养基中，在温度37℃、转速160~200r/min的条件下培养至对数生长期；

（2）载体的预处理：将陶粒投入1.0mol/L的氢氧化钠溶液中，在150r/min振荡吸附30min，再静置24h，使用蒸馏水冲洗载体至冲洗液pH呈中性，105℃干燥2h，制得碱改性陶粒载体；

（3）固定化细胞制备：将上述载体以25%~35%的装填量装填于固定床反应器床层，将种子液加入固定床反应器中进行循环流动，使菌体细胞充分接触载体而被吸附固定；固定结束后，放出废液；

（4）预培养：将发酵培养基加入固定床反应器中，以1.0~2.0L/h的流速进行循环流动培养，培养时间为30~40h，然后放出反应器中的培养液；

（5）连续发酵培养：将新鲜发酵培养基以一定的稀释率流入固定床反应器中进行连续发酵，同时流出的发酵醪液由收集罐收集，再经过3000~4000r/min离心处理10~15min，取上清液得到中性植酸酶粗酶液。

2.根据权利要求1所述的一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述活化的方法为：将菌株划线接种于LB斜面培养基上，在37℃恒温培养36~48h。

3.根据权利要求1所述的一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述种子培养基的成分为：10~20g/L葡萄糖，10~20g/L蛋白胨，3~5g/L酵母浸膏，4~6g/L氯化钠，1.5~2.5g/L氯化钙，0.3~0.5g/L硫酸镁，0.1~0.3g/L磷酸二氢钾，0.02~0.04g/L硫酸亚铁，pH6.5~7.5。

4.根据权利要求1所述的一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述陶粒的直径为2~3mm，陶粒与氢氧化钠溶液的料液比为1g:5mL。

5.根据权利要求1所述的一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述种子液的循环流速为2.0~3.0L/h。

6.根据权利要求1所述的一种利用固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的固定结束是指种子液中的菌体细胞浓度保持稳定，几乎不再下降。

7.根据权利要求1所述的一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（4）和（5）中，所述发酵培养基的成分为：30~40g/L麸皮，4~6g/L葡萄糖，10~20g/L豆饼粉，6~8g/L硫酸铵，2~3g/L植酸钠，5~7g/L氯化钠，1.5~2.5g/L氯化钙，0.1~0.2g/L磷酸二氢钾，0.2~0.4g/L硫酸镁，0.02~0.04g/L硫酸亚铁，45~55μmol/L H₂O₂，5~10g/L正十二烷，pH6.5~7.5。

8.根据权利要求1所述的一种固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（4）中，预培养的温度为36~38℃，通气量为1.6~2.0vvm。

9.根据权利要求1所述的一种利用固定化芽孢杆菌发酵生产中性植酸酶的方法，其特征在于，步骤（5）中，连续发酵培养的温度为34~36℃，通气量为1.8~2.2vvm，稀释率为0.05~0.07h^-1。