[发明专利]表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法及其在制备手足口病疫苗中的应用

说明书

本发明实施例公开了一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母细胞破碎方法及其在制备手足口病疫苗中的应用。所述方法包括下列步骤：收集重组汉逊酵母菌体，加入细胞洗涤缓冲液洗涤重悬，离心后弃上清液；加入细胞破碎缓冲液充分重悬菌体；加入苯甲基磺酰氟溶液、聚山梨酯80和酸化玻璃珠，制备成菌体悬液；将所述菌体悬液置于细胞破碎器中振荡破碎，破碎后离心取上清液，得到细胞破碎液。实施本发明，可有效保持EV71抗原活性，操作简单，破碎率高且能够同时破碎多个样本，有效节省样本处理时间。

技术领域

本发明涉及基因工程重组肠道病毒71型疫苗制备技术，尤其涉及一种表达肠道病毒71 型抗原的重组汉逊酵母的细胞破碎方法及其在制备手足口病疫苗中的应用。

背景技术

肠道病毒71型(EV71)是导致手足口病的重要病原之一。我公司构建了表达EV71抗原的重组汉逊酵母。为了对重组汉逊酵母中EV71抗原含量进行测定以监测发酵工艺的稳定性，需要对该重组汉逊酵母进行细胞破碎，释放细胞内的EV71抗原，以便对其测定。

现有技术中常用的细胞破碎方法是采用高压均质机破碎，此方法耗能大，操作繁琐，破 碎率低，且一次只能破碎一个样本。国内有报道称采用氧化锆珠作为研磨介质破碎汉逊酵母 细胞，但破碎率只能达到50-60％，破碎过程产生大量热量且造成锆残留。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母的细 胞破碎方法，该方法可有效保持EV71抗原活性，操作简单，破碎率高且能够同时破碎多个 样本，有效节省样本处理时间。

本发明进一步所要解决的技术问题是，提供一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵 母的细胞破碎方法在制备手足口病疫苗中的应用，该应用可有效保持EV71抗原活性，操作 简单，破碎率高且能够同时破碎多个样本，有效节省样本处理时间。

为解决上述技术问题，本发明公开了以下技术方案：

一种表达肠道病毒71型抗原的重组汉逊酵母细胞破碎方法，包括下列步骤：

收集重组汉逊酵母菌体，加入细胞洗涤缓冲液洗涤重悬，离心后弃上清液；

加入细胞破碎缓冲液充分重悬菌体；

加入苯甲基磺酰氟溶液、聚山梨酯80和酸化玻璃珠，制备成菌体悬液；

将所述菌体悬液置于细胞破碎器中振荡破碎，破碎后离心取上清液，得到细胞破碎液。

在一些可能的实施方式中，所述细胞洗涤缓冲液通过以下步骤制备：

按重量计，取磷酸氢二钠3.0-3.5份、磷酸二氢钠一水合物0.1-0.2份、氯化钠8.5-9.0份， 加入纯化水充分溶解混匀，调节pH值至7.5-8.5。

在一些可能的实施方式中，所述细胞洗涤缓冲液通过以下步骤制备：

按重量计，取磷酸氢二钠3.3-3.4份、磷酸二氢钠一水合物0.1-0.2份、氯化钠8.7-8.8份， 加入纯化水充分溶解混匀，调节pH值至8.0。

在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎缓冲液通过以下步骤制备：

按重量计，取磷酸氢二钠5.5-6.5份、磷酸二氢钠一水合物1.0-1.5份、氯化钠25.0-35.0 份、乙二胺四乙酸二钠0.2-0.5份、按体积计丙三醇20-80，加入纯化水充分溶解混匀，调节 pH值至7.0-7.5。

在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎缓冲液通过以下步骤制备：

按重量计，取磷酸氢二钠5.9-6.0g、磷酸二氢钠一水合物1.1-1.2g、氯化钠29.0-30.0g、 乙二胺四乙酸二钠0.3-0.4g、按体积计丙三醇40-60份，加入纯化水充分溶解混匀，调节pH 值至7.4。