[发明专利]chi-miR-450-5p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用

说明书

本发明公开了一种chi‑miR‑450‑5p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用。本发明提供的chi‑miR‑450‑5p能够反映山羊卵泡发育成熟，作为卵泡发育标志物具有可靠性、普遍性和可重复性。本发明还公开了检测山羊卵泡发育情况的试剂盒。本发明通过分离卵泡颗粒细胞验证chi‑miR‑450‑5p在优势卵泡和小卵泡颗粒细胞的表达模式，为完善与山羊卵泡生长发育、排卵的基因调控及非编码调控网络提供了依据。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及chi-miR-450-5p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用。

背景技术

山羊的产仔数是衡量其繁殖性能的重要标准，而产仔数和山羊的卵泡发育直接相关。卵泡发育是一个复杂的生物学过程，受多种调控通路和内分泌激素的严格调控。动物初情期后，在生殖激素的调节作用下，卵巢上的部分原始卵泡被募集并且启动发育。但是最终只有很少一部分卵泡能够发育至成熟卵泡并且排卵，大部分卵泡在发育过程中都发生退化闭锁。关于卵泡发育机制的研究众多，且已取得许多重要的研究成果，但是在非编码RNA，特别是山羊卵泡的miRNA研究仍然较少。

MiRNAs是在多种真核细胞中发现的一类内源性的长度为21～25个核苷酸的单链非编码RNA分子。它们由一段长度为70～80个核苷酸且具有发夹结构的miRNA前体剪切而成。MiRNAs主要通过碱基配对与靶mRNA序列的3’UTR区或编码区结合，导致靶mRNA降解或抑制其翻译，从而参与转录后水平的基因表达调控。MiRNA具有以下特征：(1)不具有开放阅读框架及蛋白质编码基因的特点；(2)在3’端有1～2个碱基的长度变化；(3)定位于能潜在编码其前体发夹结构的蛋白质非编码区域；(4)在不同物种间高度保守；(5)表达具有严格的时空性和组织特异性。miRNA在不同的物种的高度保守性以及在不同物种间序列的高度同源性与其靶基因及其生物学功能有着密切的关系。这些特征为miRNA作为新型的分子标记研究遗传和进化提供了基础。

Gay等人发现小鼠miR-202-5p缺失影响卵泡的早期发育并导致优势卵泡数量大大减少，最终导致雌性生殖力降低。Jiajie等人发现miR-10a家族能够靶向转化生长因子-β通路抑制人、小鼠和大鼠颗粒细胞的增殖并诱导细胞凋亡。随着高通量测序技术的成熟，miRNA调控人、小鼠、猪和牛卵泡发育的研究近些年已经被逐渐报道，而miRNA调控山羊大小卵泡发育的研究较少。而且现阶段对于对整个卵巢的研究较为普遍，但卵巢作为一个繁殖活动的主要器官，里面包含着各种组织以及不同类型卵泡，因此在进行卵泡发育研究时有必要对特定的卵泡类型进行细分。因此，本发明基于单个卵泡miRNA测序结果以及后续验证实验提出一种在山羊优势卵泡和小卵泡差异表达的miRNA，为深入研究山羊卵泡发育的非编码调控机制提供参考。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种chi-miR-450-5p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用。

本发明的另一目的在于提供一种检测山羊卵泡发育情况的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：chi-miR-450-5p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用。

所述的chi-miR-450-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的chi-miR-450-5p为成熟的chi-miR-450-5p。

所述的chi-miR-450-5p表达上调，提示山羊卵泡发育成熟。

所述的chi-miR-450-5p的筛选方法，包括如下步骤：

S1：采集发情处理后的山羊卵巢组织，分离出小卵泡和优势卵泡，分别提取RNA；

S2：采用步骤S1的RNA进行miRNA-seq，对差异表达的miRNA进行GO和KEGG富集分析，筛选出与细胞趋化因子通路相关的chi-miR-450-5p；