[发明专利]富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料、其制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料、其制备方法及应用。所述制备方法包括：构建包含有CBD‑VEGFa融合基因的重组载体，再利用所述重组载体将所述CBD‑VEGFa融合基因导入宿主细胞，进而构建能够表达所述血管内皮生长因子a的重组细胞；将所述重组细胞接种到培养皿上进行培养；将附着在培养皿上的重组细胞冻干，获得富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质。本发明构建了携带有胶原结合区域的VEGFa，进而使VEGFa蛋白结合到ECM的胶原I上，达到在ECM上富集的目的，本发明制备的富含VEGFa的片状细胞外基质材料可以诱导间充质干细胞分化成内皮细胞。

技术领域

本发明涉及一种细胞外基质的制备方法，具体涉及一种含有CBD(CollagenBinding Domain，胶原结合域的简称，可以和胶原结合的一段肽段)的VEGFa融合基因、重组表达载体、富含血管内皮生长因子a的片状细胞外基质材料、其制备方法及其应用，属于生物材料与组织工程技术领域。

背景技术

血管性疾病是威胁人类健康的主要疾病种类之一。而其中的缺血性疾病又占近25.6％，尤其以心肌梗死、大脑缺血和肢体缺血为主。组织在缺血条件下，不能有效进行气体、营养物质和代谢废物的交换，最终导致功能性障碍直至坏死。近年来，越来越多的实验证明间充质干细胞可以有效的促进缺血组织的血管再生。通过研究结果基本证实，间充质干细胞可能通过分化成血管内皮细胞和分泌血管再生相关细胞因子两种途径来影响和促进血管的再生(Aref,Z.,M.R.de Vries,and P.H.A.Quax,Variations in SurgicalProcedures for Inducing Hind Limb Ischemia in Mice and the Impact of TheseVariations on Neovascularization Assessment.Int J Mol Sci,2019.20(15).；Wang,Z.,et al.,Human Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells Relieve HindLimb Ischemia by Promoting Angiogenesis in Mice.Stem Cells Dev,2019.28(20):1384-1397.)。内皮细胞(Endothelial cell，ECs)作为形成血管内膜的单细胞，通过响应血管生成刺激，调节血管通透性，触发血栓形成过程，并与血液中的多种成分相互作用，在维持血管稳态中发挥重要作用(Xu,Y.,et al.,Umbilical cord-derived mesenchymal stemcells isolated by a novel explantation technique can differentiate intofunctional endothelial cells and promote revascularization.Stem Cells Dev,2010.19(10):1511-22.)。将内皮细胞导入缺血组织是一种通过促进血管生成来恢复器官功能的新方法。目前内皮细胞的获取方法主要有三种：①自体内皮细胞；②内皮细胞分化培养基诱导间充质干细胞分化为内皮细胞；③生物材料诱导间充质干细胞分化为内皮细胞。

细胞外基质为细胞提供赖以生存的外部环境，在细胞间起支撑和连接作用，调节组织的发生和细胞的正常生理活动。ECM作为理想的生物学材料来源，广泛应用于组织工程和再生医学领域。ECM材料主要有两大来源：①特定组织器官直接脱细胞制备而成；②细胞衍生制备ECM(Theocharis,A.D.,et al.,Extracellular matrix structure.Adv DrugDeliv Rev,2016.97:4-27.)。ECM材料普遍制备过程是首先体外培养的细胞或组织器官产生ECM，其次脱细胞制备ECM，最后冻干保存ECM。