[发明专利]一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用方法

权利要求书

1.一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，其特征是按以下步骤操作：

（1）提取东北林蛙脚趾组织的基因组DNA，

（2）以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，PCR扩增反应所用上游引物为SEQ IDNO :1所示序列，即5’-GGCTATTCGTCGCTACTAAAGG-3’ ，下游引物为SEQ ID NO :2所示序列，即5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’；

（3）用14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应的222bp条带的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙；

（4）对遗传雄性特异性条带进行回收纯化、测序，确定其为东北林蛙性别特异性分子标记，即SEQ ID NO :3，所述分子标记表现为SEQ ID NO :3 所示核苷酸序列，

GGCTATTCGTCGCTACTAAAGGTGGGGTCACTGGCACTTAATGCTGCCCAGTTCTGGGTCTCTAAAGAAGGACCGTTTAACATGAGAGTCTATGGGGAAACAGGGTCATCTTTAGGCATGTGCAGAAGTGAAAAATTTGTTTTGTTTCGTTTCGTTTCAATTCGTCATTTAATACATTTCGTTAAGTTAGGTTCGTTACATGTGTCAAATTCGTACGCAGTC

具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的个体，表现为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO3所示核苷酸序列的个体为遗传雌性东北林蛙。

2.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，其特征是，所述引物对具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列:

SEQ ID NO :1

GGCTATTCGTCGCTACTAAAGG

SEQ ID NO 2:

GACTGCGTACGAATTTGA。

3.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，其特征是，利用所述引物对SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 2对待检测东北林蛙基因组进行PCR扩增，当所述扩增产物存在大小为222bp条带时，表明所述待测东北林蛙基因组DNA中具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，判断待测东北林蛙遗传性别是雄性；当没有出现所述扩增片段时，所述待测个体基因组DNA中缺失SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，待测东北林蛙遗传性别是雌性。

4.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，其特征是，分析PCR扩增产物时，优选14%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所述扩增产物。

5.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，其特征是，分析PCR扩增产物时，电泳电压为120V，电泳时间为10~14h。

6.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，其特征是，扩增时，反应体系为10μl，包括10×Buffer（Tris-HCL 200 mM， pH 8.4； KCl 500 mM）1 μl，dNTP（2.5mM）0.2μl, Taq聚合酶（5 U/μl）0.1μl，灭菌去离子水7.1μl，上游引物（10 pm/pl）0.4μl、下游引物（10 pm/pl）0.4μl，模板（50 ng/μl）0.8μl。

7.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，其特征是，扩增时，反应条件为：94℃ 4 min，1个循环；94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min， 5个循环；94℃ 1 min， 51℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min, 1个循环，4℃保存。

8.如权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记的应用，其特征是，用于制备鉴定待测东北林蛙的遗传性别的试剂盒。

9.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，其特征是，应用权利要求1的步骤方法，所述分子标记表现为SEQ ID NO :3 所示核苷酸序列确定待测东北林蛙的遗传性别，获得伪雄个体，作为父本与正常雌性抱对排卵，获得高雌性比例的子代。