[发明专利]一种生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法

说明书

本发明公开了一种生物催化制备(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的方法，属于生物技术领域，通过酮还原酶突变体能将4‑氯乙酰乙酸乙酯转化生成(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，酮还原酶突变体源于Meyerozyma guilliermondii的野生型酮还原酶，与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，该酮还原酶突变体的序列为SEQ ID NO.4。本发明整个体系使用单酶或双酶催化，使用葡萄糖或醇类用于辅酶循环，底物浓度高达120g/L‑200g/L，手性纯度大于99％，底物用量/NAD用量高达3017∶1，辅酶循环次数高，有效的扩大了下游应用范围。

技术领域

本发明涉及一种生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，属于生物技术领域。

背景技术

酮还原酶是一种多用途催化剂，通过醛或酮的对映体选择性还原成对应醇。(R)特异性酮还原酶与(S)特异性酮还原酶具有不同特性，并且这些催化剂在光学活性醇的工业合成中被越来越频繁地用到。旋光性是许多医药和农药活性化合物选择性作用的必要条件，在一些情况下，一个对映体具有有益的药物活性，另一个对映体却具有基因毒性作用。因此，在药用和农药用活性化合物的合成中，需要使用具有所要求的立体特异性的催化剂合成光学活性醇。

手性纯的(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是一种重要的手性醇。(R)-CHBE(4-氯-3-羟基丁酸乙酯)已经被用作(R)-肉碱，R-4-氨基-3-羟基丁酸，(R)-4-羟基-2-吡咯烷酮和其他五烯化学品的主要前体。并且近年来有报道将(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯用于超级他汀类药物的新合成路线，有望打破原合成工艺的专利垄断。一些属于SDRs的氧化还原酶已被筛选并应用于生物还原4-氯乙酰乙酸乙酯为CHBE(4-氯-3-羟基丁酸乙酯)。大多数报道的微生物酶产生的都是(S)型CHBE，并同时具有高对映选择性和高产率。但是，仅有极少有酶能产生(R)型CHBE，并伴随立体选择性较低(如70％e.e.)或产率低等特性。许等人报道了一株产酮的芽孢杆菌还原酶，其中一个羰基还原酶能转化COBE为(R)-CHBE(99.6％e.e.)，收率为91.7％，但是需要用到水-甲苯两相系统，底物需要分三次加入反应体系，增加了生产成本并加重了生产负担；并且该催化体系活力偏低，需要依赖投入大量的酶或细胞才能使反应结束(0.5g干细胞催化2.158g底物)，对于市场需用量大价格低廉的中间体CHBE来说该工艺几乎不具有放大前景。

日本人Kataoka等使用Sporobolomyces salmonicolor来源的酮还原酶被用来做(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，底物浓度高达300gL，但是只有92％的手性纯度，无法应用于对手性纯度高要求的药物合成。

中国专利CN104988085A利用(R)4-氯-3-羟基丁酸乙酯及其衍生物的生物合成方法，以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)及其衍生物为起始原料，利用重组E.coli CCZU-H15静息细胞为生物催化剂，以葡萄糖为辅底物，实现了(R)-CHBE及其衍生物的合成。

中国专利CN 103160547中利用Candida albicans来源的醇脱氢酶不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯，以醇脱氢酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADH为辅因子，不对称还原制备(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。但是底物浓度仅为25g/L-50g/L，且投酶量过高(5g菌体/25ml体系)，转化率低，不具备工业生产前景。

发明内容

本发明的主要目的是为了提供一种生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：