[发明专利]一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法及应用

权利要求书

1.一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，其特征在于，按照以下步骤实施：

步骤1、敲除铜绿假单胞菌的pelF，pslA-B、pscF、fabV基因，经筛选、鉴定获得无抗性筛选标记的基因删除突变株PAO1△4；

步骤2、将胞外多糖水解酶PelA、PslG，糖苷水解酶DspB，诱导金黄色葡萄球菌裂解的溶葡萄球菌素蛋白Lys的编码基因串联克隆到表达载体pBBR1MCS-6，获得重组质粒pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys；

步骤3、将铜绿假单胞菌的PA2069启动子与溶菌素激活蛋白基因prtN融合并克隆至pUT18C-mini-Tn7T-Gm，获得重组质粒pUT18C-mini-Tn7T-P_PA2069-prtN-Gm；

步骤4、将步骤1得到的PAO1△4继续敲除铜绿假单胞菌基因组上编码Pf4噬菌体的基因簇，经筛选、鉴定获得Pf4无抗性筛选标记的基因删除突变株PAO1△5；

步骤5、将步骤3获得的重组质粒pUT18C-mini-Tn7T-P_PA2069-prtN-Gm与辅助质粒pTNS3共转化至步骤4获得的PAO1△5菌株中，经抗性筛选获得基因组融合菌株PAO1△5∷pUT18C-mini-Tn7T-P_PA2069-prtN-Gm，通过质粒接合转移和抗性筛选利用辅助质粒pFLP2去除PAO1△5∷pUT18C-mini-Tn7T-P_PA2069-prtN-Gm菌株中的抗性基因，获得无Gm抗性筛选标记基因的菌株PAO1△5attTn7∷P_PA2069-prtN；通过质粒接合转移将步骤2获得的重组质粒pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys转化到PAO1△5attTn7∷P_PA2069-prtN菌株中，获得最终的工程菌PAO1104。

2.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤1包括以下具体步骤：

以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板分别PCR扩增pelF的上下游序列，通过重叠延伸PCR构建△pelF，从质粒p34s-Gm上酶切抗性基因Gm^R，将Gm^R基因连接到△pelF的一侧，构建基因敲除盒△pelF-Gm^R，将△pelF-Gm^R克隆至自杀载体pK18mobsacB上，转化大肠杆菌S17-1构建重组菌，并通过接合作用将重组菌中的重组自杀性载体导入铜绿假单胞菌，结合抗性筛选、蔗糖筛选和PCR鉴定，获得无抗性筛选标记的pelF基因删除突变株PAO1△1，按照上述方法继续连续敲除pslA-B、pscF和fabV，获得四重基因突变株PAO1△4。

3.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤2包括以下具体步骤：

分别PCR扩增铜绿假单胞菌的fabV基因序列和pBBR1MCS-5载体上的非Gm抗性基因序列，经酶切和连接构建重组载体pBBR1MCS-5-Gm^R::fabV；同时PCR扩增pME6032载体上tac启动子，克隆至重组载体pBBR1MCS-5-Gm^R::fabV上，获得双启动子重组载体pBBR1MCS-5-P_tac-Gm^R::fabV，命名为pBBR1MCS-6；PCR扩增铜绿假单胞菌PAO1的胞外多糖水解酶基因pelA和pslG、放线共生放线杆菌CU1000的糖苷水解酶基因dspB，金黄色葡萄球菌NRRLB-2628中不包含前导肽的溶葡萄球菌素编码基因lys，经酶切后连接到pBBR1MCS-6载体上，构建重组载体pBBR1MCS-6-pelA-pslG-dspB-lys，转化大肠杆菌S17-1获得重组菌株S17-A。

4.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤3包括以下具体步骤：

PCR扩增铜绿假单胞菌的PA2069启动子和prtN基因，经酶切，连接到pUC18T-mini-Tn7T-Gm质粒上，获得重组质粒pUC18T-mini-Tn7T-P_PA2069-prtN-Gm。