[发明专利]一种CD27人源化小鼠模型的构建方法及其应用

说明书

本发明提供了一种制备CD27基因人源化动物的方法，该方法通过同源重组将动物来源的CD27基因编码的胞外替换为人源CD27基因编码的胞外区，保留动物来源CD27基因的胞内区，该方法成功构建了人源化CD27动物模型，该模型能够用于CD27靶向药物或评价CD27靶向药物和其他药物联用的疗效评价。

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于基因编辑技术的CD27基因修饰人源化动物模型的构建方法。

背景技术

在近几十年里，肿瘤免疫疗法的发展，特别是免疫检查点分子的发现及应用，颠覆了传统肿瘤治疗。免疫检查点分子是一类表达在免疫细胞表面，可以激活或抑制免疫细胞的功能。利用免疫检测点治疗肿瘤就是通过抗体刺激或抑制免疫检查点蛋白的信号传导，最终是激活免疫细胞对肿瘤细胞的免疫反应。其中抑制性分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和程序性细胞死亡受体1(PD-1)是目前研究最多的两个免疫检查点分子。在此基础上，又挖掘出更多新的免疫检查点分子进入临床试验阶段，包括CD27、CD40、OX40、TIM3、GITR、ICOS等，都成为肿瘤免疫药物研究的标靶。

CD27是TNF受体超家族中的一员，主要表达在T细胞、B细胞及NK细胞表面。当CD27与它的配体CD70结合后，可活化T、B细胞并促进其增殖，也可增强NK细胞的活化和功能。临床前研究发现，CD27激活型抗体能够有效激活免疫细胞对淋巴癌和B16黑色素瘤的抗肿瘤免疫效应，为肿瘤免疫疗法提供了新靶点。目前已有2个抗体进入临床阶段，分别抗体药Cusatuzumab和Varlilumab。

免疫检查点药物的筛选及临床前试验需要在动物模型上进行评价，啮齿类动物作为应用最广泛的实验小动物模型，已成为人类肿瘤治疗研究中不可或缺的替代模型。但由于种属性的差异，在小鼠上筛选的免疫检查点抗体并不完全试用于人类。

为了解决该问题，我们通过基因修饰的方法，将人类的编码基因替换小鼠相应的基因，制备的免疫检查点人源化小鼠模型，具有人类的功能性基因，可用来筛选评价人类的免疫检查点药物。CD27人源化小鼠是指利用基因修饰的方法，在免疫系统健全的小鼠上，将鼠源CD27的胞外区编码基因替换为人源CD27胞外区编码基因，构建能与抗人源CD27抗体相互作用又对内部信号转导不会产生影响的小鼠模型。该模型与普通小鼠相比，实现了关键靶分子的人源化改造，并且保留了完整的免疫系统，可用于筛选和评价针对人类基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。同时我们将自主研发的PD1人源化小鼠与CD27人源化小鼠配繁，获得PD1与CD27均人源化小鼠模型，能够用于评价人类PD1抗体，CD27抗体以及两者联合使用的肿瘤抑制效果及药物的安全性评价，为临床实验提供更有效的用药策略。

在CD27人源化小鼠的过程中，我们对于基因编辑技术中用到的各个原件和步骤包括人源化区域的选择、同源重组过程中的同源臂的设计、打靶载体的构建、转染、阳新克隆筛选、囊胚注射、受体移植等各项都进行了优化和调整，保证了采用该技术制备CD27人源化动物模型的高成功率和高准确率。

发明内容

本发明提供了一种制备CD27基因人源化动物的方法，其特征在于，包括将动物来源的CD27基因编码的胞外替换为人源CD27基因编码的胞外区，保留动物来源CD27基因的胞内区，所述人源CD27基因编码的胞外区氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

优选地，利用同源重组将人源CD27基因编码的胞外区替换动物源CD27基因编码的胞外区，打靶成功的CD27嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

优选地，该方法具体包括如下步骤：

1)打靶载体的构建：利用同源重组原理进行打靶载体设计，所述打靶载体包含a)与待改变的动物源基因区5’端同源的DNA片段，即5’同源臂，b)插入的人源DNA序列；和c)与待改变的动物源基因区3’端同源的第二个DNA片段，即3’同源臂；