[发明专利]一种自体滋养细胞的制备方法和SNK细胞的培养方法

说明书

本发明提供了一种自体滋养细胞的制备培养方法和SNK细胞的培养方法，属于医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学技术领域，包括以下步骤：1)将41BBL‑MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL‑MICA融合基因的慢病毒；2)将所述步骤1)得到的含有41BBL‑MICA融合基因的慢病毒感染外周血单核细胞，培养14d以上，得到的CD3‑41BBL+MICA+细胞为自体滋养细胞。采用本发明提供的培养方法培养得到的滋养细胞为自体来源，保证安全性，无需经过照射，操作方便。

技术领域

本发明属于医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学技术领域，尤其涉及一种自体滋养细胞的制备方法和SNK细胞的培养方法。

背景技术

常见的NK细胞培养方法有一下几种：1.从自体的PBMC中，分离NK 细胞，进行培养，缺点，扩增数量少，CD56+CD16+比例不高，NK活性不高；2.异体干细胞来源，诱导培养NK细胞，缺点，异体来源风险， CD56+CD16+比例不高，NK活性不高；3.使用的滋养细胞为K562，由于K562为肿瘤细胞系，在应用时，存在一定风险，且必须经过辐照方能使用，增加使用难度，且，CD56+CD16+比例不高，NK仅对B细胞或淋巴瘤有一定杀伤活性，对实体瘤的杀伤活性不高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种自体滋养细胞的制备方法和SNK 细胞的培养方法，采用本发明提供的方法制备得到的自体滋养细胞为自体来源(即和外周血单核细胞一个来源)，保证安全性，无需经过照射，操作方便，并且可刺激PBMC(外周血单核细胞)中的CD56+CD16+NK细胞扩增，得到的NK细胞对多种实体瘤均有较强的杀伤作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种自体滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)将41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒；

2)将所述步骤1)得到的含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒感染外周血单核细胞，培养14d以上，得到的CD3-41BBL+MICA+细胞为自体滋养细胞。

优选的，所述步骤1)41BBL-MICA融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述步骤1)慢病毒表达载体包括pCDH载体。

优选的，所述步骤1)感受态细胞包括大肠杆菌感受态细胞。

优选的，所述步骤2)培养使用的培养基以1640培养基为基础培养基，包括质量百分含量为8～12％的胎牛血清和浓度为180～220IU/mL的IL-2。

本发明还提供了一种SNK细胞的培养方法，采用上述技术方案所述的制备方法得到自体滋养细胞，将所述自体滋养细胞与外周血单核细胞混合后培养14～28d，得到SNK细胞。

优选的，所述自体滋养细胞与外周血单核细胞的数量比为1～500:1～10。

优选的，所述培养的温度为35～42℃，所述培养的CO₂体积浓度为5％。

本发明提供了一种自体滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：1)将 41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒；2)将所述步骤1)得到的含有 41BBL-MICA融合基因的慢病毒感染外周血单核细胞，培养14d以上，得到的CD3-41BBL+MICA+细胞为自体滋养细胞。采用本发明提供的制备方法得到的自体滋养细胞为自体来源，保证安全性，无需经过照射，操作方便。