[发明专利]无细胞表达rhUTI蛋白系统及生产rhUTI蛋白的方法

说明书

本申请提供了一种无细胞表达rhUTI蛋白系统及生产rhUTI蛋白的方法。所述无细胞表达rhUTI蛋白系统包括如下成分：无细胞蛋白表达体系、表达质粒；所述无细胞蛋白表达体系包括细胞提取物、补充体系；所述补充体系包括：第一缓冲液或其功能等同体、镁盐或其功能等同体、钾盐或其功能等同体、草酸盐或其功能等同体、氨基酸或氨基酸混合物或其功能等同体、核苷酸混合物或其功能等同体；所述表达质粒含有密码子优化的rhUTI基因。

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体涉及无细胞表达rhUTI蛋白系统及生产rhUTI蛋白的方法。

背景技术

人尿胰蛋白酶抑制剂(human Urinary trypsin inhibitor，以下简称为hUTI)最初是从新鲜人尿中提取的一种能抑制多种蛋白水解酶活力的糖蛋白，也称为乌司他丁或尿抑素。

hUTI存在于正常的人的尿液和血液中，由a-microglobulin precursor(AMBP)基因编码，含有两个Kunitz型结构域，对胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、纤溶酶(plasmin)等在内的多种蛋白酶具有较强的抑制作用。此外hUTI还可通过抑制脂多糖诱导的细胞因子合成发挥抗炎作用；对肿瘤细胞浸润和转移具有抑制作用。

1909年，Beuer和Reich首次报道了人体尿液中存在胰蛋白酶抑制剂。1985年从人尿中提取的hUTI首次在日本上市，其主要适应症为胰腺炎和休克所致的急性循环衰竭。1999年广东天普生化医药公司在国内推出“注射用尿抑素”，填补了国内的空白。目前，临床上hUTI被广泛用于治疗急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性发作、急性循环衰竭、弥散性血管内凝血(DIC)，肿瘤、休克和外科手术中辅助用药，防治顺铂化疗时对肾功能的损伤，AIDS的辅助治疗以及先兆流产的预防和治疗等。

目前，市场上商业化的hUTI制剂产品都从人尿中提取。研究表明，利用大肠杆菌(E.coli)表达的重组人尿胰蛋白酶抑制剂(Recombinant Human Urinary trypsininhibitor，rhUTI)也同样对胰蛋白酶具有抑制作用。由于利用基因工程技术表达重组蛋白可以避免从尿液中提取蛋白存在的来源限制、样品污染、后提取工艺复杂等，目前已成为研究热点。然而，目前利用基因工程手段从E.coli中获得的rhUTI产量低，难以满足商业化要求。

发明内容

针对现有技术的不足，本申请采用下述技术方案：

本申请的第一个方面提供了一种无细胞表达rhUTI蛋白系统，所述无细胞表达rhUTI蛋白系统包括如下成分：

无细胞蛋白表达体系、表达质粒；

所述无细胞蛋白表达体系包括细胞提取物、补充体系；

所述补充体系包括：第一缓冲液或其功能等同体、镁盐或其功能等同体、钾盐或其功能等同体、草酸盐或其功能等同体、氨基酸或氨基酸混合物或其功能等同体、核苷酸混合物或其功能等同体；

所述表达质粒含有密码子优化的rhUTI基因，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述细胞提取物选自大肠杆菌细胞提取物、酵母细胞提取物、小麦胚芽提取物、昆虫细胞提取物、兔网织红细胞提取物、CHO细胞提取物中的任意一种或几种的任意组合。

优选地，所述第一缓冲液的摩尔浓度为2～100mM；或/和

所述镁盐中含有的镁离子的摩尔浓度为0.5～20mM；或/和

所述钾盐中含有的钾离子的摩尔浓度为100～350mM；或/和

所述草酸盐的摩尔浓度为0.5～10mM；或/和

所述氨基酸或氨基酸混合物的摩尔浓度为1～3mM；或/和