[发明专利]一种慢病毒表达载体的设计及应用

权利要求书

1.一种慢病毒表达载体，其特征在于：慢病毒表达载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.一种基于权利要求1所述的慢病毒表达载体的应用，其特征在于：基于其核苷酸序列，可应用于下述五个方面：可插入目的基因、可包装为慢病毒感染目的细胞、可高水平表达插入目的基因、可通过嘌呤霉素筛选获得稳转细胞株、可通过GFP检测转染效率。

3.一种基于权利要求1所述的慢病毒表达载体的应用方法，其特征在于：

(1)插入目的基因：通过PCR技术获得插入目的基因的片段，采用酶切连接的方法将目的基因片段插入慢病毒表达载体的多克隆位点；

(2)包装为慢病毒感染目的细胞：

慢病毒表达载体在293T细胞中转录生成病毒基因组RNA，包装载体在293T细胞中转录翻译生成病毒蛋白，然后病毒基因组RNA与病毒蛋白在细胞中组装成慢病毒，慢病毒从293T细胞中释放到培养基中，收集慢病毒，将慢病毒与目的细胞共孵育，感染目的细胞；

(3)通过嘌呤霉素筛选步骤(2)中慢病毒感染后的细胞获得稳转细胞株：慢病毒感染目的细胞48h后，加入嘌呤霉素至2-10μg/mL，培养3代以上，直至细胞不再死亡，获得稳定细胞株，收集稳定细胞株，通过westernblot检测插入目的基因的表达量；

(4)高水平表达插入目的基因：通过westernblot检测，慢病毒感染48h后的目的细胞或稳转细胞中，目的基因的表达，判定是否高水平表达；

(5)通过GFP检测转染效率：该慢病毒转染293T细胞后，或者包装好的慢病毒感染目的细胞后，都可以通过荧光显微镜观察GFP的强度判定转染效率。

4.根据权利要求3所述的一种慢病毒表达载体的应用方法，其特征在于：所述酶切连接中酶切位点为BamHI、SalI、XhoI、XbaI。