[发明专利]脱敏治疗药物的活性检测方法

说明书

本发明涉及一种脱敏治疗药物的活性检测方法，为其质量控制提供方法学依据。体外测定IgE以确定脱敏治疗药物总生物学活性的方法主要有放射性变应原吸附性实验(RAST抑制试验)、免疫印迹试验等，但这些方法仍然无法做到变应原制剂活性的标准化检测。本发明建立了一种新型的脱敏治疗药物活性定量检测方法，包括标准血清库建立、血清IgE抑制率测算、变应原蛋白活性测算等步骤。该检测方法重复性好、准确度高，可以有效地反应脱敏治疗药物生物学活性，对脱敏治疗药物的生产工艺研究、质量控制具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种脱敏治疗药物的活性检测方法。

背景技术

1998年WHO正式宣布检测变应原并进行特异性免疫治疗是唯一可以影响过敏性疾病自然进程的对因治疗方法。特异性免疫治疗是确定导致患者过敏的变应原种类后，在非急性期使患者与该种类变应原制剂反复接触，剂量由小到大逐渐递增，至最佳维持剂量，提高患者对变应原的耐受性，从而达到控制或减轻过敏症状的一种疗法。

变应原制剂是将从变应原天然成分中提取或通过基因重组技术制备得到的变应原蛋白，制成一定浓度的溶液，用于诊断、预防和治疗的生物制品。变应原生物学活性测定是质量控制的一项重要指标，也是目前变应原制品质量控制的重点和难点。生物单位(biological unit，BU)、生物等效变态反应单位(bioequivalent allergy unit，BAU)，是欧美使用的体内生物学评价单位，以过敏患者皮试结果来标定，反映变应原制品的总活性效价。体外测定IgE以确定变应原总生物学活性的方法有放射性变应原吸附性实验(RAST抑制试验)、免疫印迹试验等。由于缺乏不同批次间稳定的血清池，这些方法仍然无法做到变应原制剂的标准化。

目前国内外尚无统一、标准化的用于脱敏治疗的变应原活性检测方法，所以建立一种变应原制品生物学活性检测方法，用于制备标准化的变应原尤为迫切。

发明内容

本发明的目的是建立一种用于脱敏治疗的变应原蛋白活性检测方法，为其质量控制提供方法学依据。

首先建立标准血清库，并对其进行赋值；将变应原蛋白包被在酶标板；将变应原蛋白样品系列稀释后与血清库血清孵育；孵育后的混合物加于预包被了变应原蛋白的酶标板中；建立起“抑制率-稀释倍数”的线性关系，并规定抑制率为50％的生物学活性为100BU/ml，即可计算出变应原蛋白的生物学活性。

具体地，首先，利用Phadia100过敏原检测系统对每份血清DP和DF特异性IgE含量进行精确测定；按照正态分布原则，将特异性IgE检测值为10～150Kua/L进行合并，制备得到标准血清库；再次利用Phadia100过敏原检测系统对标准血清库中DP和DF特异性IgE含量进行精确测定，作为后续方法开发和验证的标准血清库。

后续测定方法具体包括以下步骤：

包被：用包被液将变应原蛋白样品稀释后加入包被孔中孵育；

封闭：洗涤包被孔，并加入封闭液孵育；

样品稀释：待测变应原蛋白样品梯度稀释；

混合孵育：将上述稀释的样品分别与血清混合孵育；

加样孵育：孵育好的样品加入包被孔，继续孵育；

二抗孵育：包被孔洗涤后加入二抗，孵育；

显色读数；

计算：抑制率％＝(阳性值-样品值)/阳性值，以抑制率％作为横坐标，以Log₁₀稀释倍数为纵坐标，做二次曲线拟合；将50％抑制率代入曲线方程，计算出稀释倍数；生物学活性值(BU/ml)＝稀释倍数×100；比活(BU/mg)＝生物学活性值/蛋白浓度。