[发明专利]一种多功能免疫杀伤转基因细胞

权利要求书

1.一种多功能免疫杀伤转基因细胞，其特征在于：所述细胞具有细胞杀伤毒性，并且能够表达含有人恒定区的全长抗体；所述细胞为细胞免疫效应细胞，所述细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞、T细胞、细胞毒杀伤细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞中的任意一种或多种，所述含有人恒定区的全长抗体选自人鼠嵌合抗体、人源化抗体以及人抗体，并且含有人恒定区的全长抗体是通过转染病毒载体表达的，使用负载HBsAg的树突状细胞免疫1周，分离CD8+T细胞，检测HBV特异性CD8+T细胞杀伤活性，流式细胞仪技术检测免疫前后脾脏CD8+记忆性T细胞亚群比例变化，脾脏HBV特异性细胞毒性T细胞杀伤活性及IFN-γ分泌水平，RT-PCR检出HBET细胞hTERT mRNA表达，蛋白印迹法验证了HBET细胞HA的表达，端粒酶活性检测表明HBET细胞中端粒酶活性明显增高；蛋白印迹检测结果显示。

2.根据权利要求1所述的一种多功能免疫杀伤转基因细胞，其特征在于：所述含有人恒定区的全长抗体是通过转染非病毒载体表达的。

3.根据权利要求1所述的一种多功能免疫杀伤转基因细胞，其特征在于：所述抗体为抗肿瘤或抗病毒的抗体。

4.根据权利要求1所述的一种多功能免疫杀伤转基因细胞，其特征在于：所述RT-PCR验证HBETR-1A1细胞CYP1A，mRNA的表达，蛋白印迹结果表明HBETR-1A1细胞CYP1A1蛋白的表达是对照HBETR-V细胞的2.7倍。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种多功能免疫杀伤转基因细胞，其特征在于：其制备方法具体包括以下步骤：

S1、加入2ml的淋巴细胞分离液，3000xg离心20分钟，分离得到单个核细胞，以1ml的TrizoL液溶解细胞，抽提总RNA并进行逆转录，以上述引物进行扩增，得到CD14基因片段，PCR反应条件为94℃，5分钟、94℃，30秒、57℃，30秒、,72℃，50秒、共30个循环；

S2、0.8％琼脂糖电泳显示扩增出目的基因片段，取PCR产物2μl克隆到pGEM-TEasyVector中；

S3、将I双酶切纯化的pGEM*T Easy/CD14和pcDNA3.1(+)，0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过QIA quickGel切胶回收目的片段和空载体，按摩尔比3:1进行连接，连接产物转化DH5a感受态，挑取单菌落扩大培养后抽提质粒，HindM和XbaI双酶切鉴定，将重组质粒pcDNA3.1(+)/CD14纯化后转染B16pS3；

S4、将含有人恒定区的全长抗体转入具有细胞杀伤毒性的细胞并表达。

6.根据权利要求5所述的一种多功能免疫杀伤转基因细胞的其制备方法，其特征在于：所述S1中20个循环结束后再次在72℃的条件下延伸7分钟。

7.根据权利要求5所述的一种多功能免疫杀伤转基因细胞的其制备方法，其特征在于：所述S4中细胞为细胞免疫效应细胞。