[发明专利]一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法

权利要求书

1.一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，利用5-hmU激酶实现γ-硫代磷酸酯从5-O-硫代三磷酸腺苷转移到5-hmU，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶；然后，通过液相色谱-串联质谱法对产生的5-硫代磷酸甲基尿嘧啶进行表征，并利用交联化学标记巯基对DNA上的5-羟甲基尿嘧啶实现特异性标记。

2.根据权利要求1所述的DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶的具体操作如下：

1)制备含有用于限制性核酸内切酶NcoI的识别序列的dsDNA寡核苷酸作为5-hmU激酶的底物；

2)通过体外DNA聚合酶催化引物的延伸，制备包含不同碱基对位点的dsDNA模型底物；

3)将含5-hmU：A的dsDNA产物与G模板一起温育进行链置换反应；

4)采用5-hmU激酶使ATP-γ-S硫代磷酸化5-hmU：A中的5-hmU残基，得到5-硫代磷酸甲基尿嘧啶。

3.根据权利要求2所述的DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，步骤1)中，用于限制性核酸内切酶NcoI的识别序列为5'-CCAXGG-3'，其中，X＝T，U，hmU和fU。

4.根据权利要求2所述的DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，步骤2)中，不同碱基对包括：

5hmU：A，5hmC：G，5fC：G，5fU：A，U：A或T：A。

5.根据权利要求2所述的DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，步骤4)具体操作如下：

向样品中加入10U 5-hmU激酶和1mM ATP-γ-S，在浓度为1×的Cutsmart缓冲液反应体系中，在37℃，300rpm条件下振荡反应2小时，然后将微凝胶用1xPBS洗涤3次，得到5-硫代磷酸甲基尿嘧啶。

6.根据权利要求1所述的DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，利用交联化学标记巯基的具体操作如下：

通过加入不同的巯基反应性试剂与硫代磷酸酯基进行巯基反应，对不同5-hmU位点进行特异性识别和标记，以在同一基因组DNA样品或者单个细胞中区分5-hmU。

7.根据权利要求6所述的DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，巯基反应在37℃、避光条件下反应1h。