[发明专利]循环肿瘤细胞的检测方法

说明书

本发明涉及一种循环肿瘤细胞的检测方法，包括如下步骤：1）待测血液处理：采用密度梯度离心法对待测血液进行离心，离心后体系分为四层，白细胞和循环肿瘤细胞处于自上而下的第二层，将其中所述第二层与其他层分离并取出，得到检测液；2）循环肿瘤细胞富集：使所述检测液通过富集筛选机构进行富集；3）采用细胞核染料以及荧光标记抗体对步骤2）中富集的循环肿瘤细胞进行染色；4）荧光检测。本发明的循环肿瘤细胞的检测方法，采用密度梯度离心液对样本进行预处理，提高CTCs富集稳定性，极大地降低了血液中红细胞的干扰，且采用富集筛选机构进行循环肿瘤细胞的富集，能够在富集筛选机构中实现原位染色，避免了转移导致CTCs丢失的问题，提高了CTCs的回收率。

技术领域

本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞的检测方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(Circulating Tumour Cells, CTCs)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。

早在1889年，Paget提出了“种子和土壤”的学说，他认为处于旺盛生长状态的肿瘤细胞作为“种子”，当遇到合适的环境——即“土壤”时，就会发生肿瘤的转移。在1896年，澳大利亚学者Ashworth在一例转移性肿瘤患者血液中首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，提出了CTCs的概念。

近几年CTCs在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现逐渐崭露头角，被称为“液体活检”，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，临床应用价值极其显著：（1）与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，优势显著，可更加敏感地发现疾病的变化，更加科学、迅速地评价某一治疗方案的效果；（2）分离富集CTCs只需抽取患者少量外周血，对患者没有副作用，因此可以高频度的监测，达到实时监测疾病进展的目的；（3）更为重要的是，CTCs可作为分析患者肿瘤生物学特征的实时样本，可以发现患者的实时生物学变化，并根据结果及时调整治疗方案，实现实时的个体化治疗。

现有技术中CTCs直接检测方法主要有两大类：一类是基于CTCs物理尺寸的粗分离，例如，使用孔径8um的滤膜，设想CTCs尺寸普遍大于8um，通过过滤方法筛选CTCs。但是，很多白细胞粒径大于8um，并且不同时期的CTCs，如进入休眠期的CTCs，可以轻易穿过8um孔径滤膜，导致白细胞堵塞滤膜和CTCs漏检情况。另一类是基于细胞表面抗原标志物的分离，该方法最具代表性产品是强生公司的CellSearch全自动CTCs检测仪，是惟一被FDA和CFDA批准的用于CTCs临床检测的技术。但是该方法使用的是免疫磁珠，分离出的CTCs活性较差，存在检测灵敏度较差、漏检等问题。

针对上述问题，现有技术中已经出现采用富集筛选机构对循环肿瘤细胞进行富集和检测的方案。如申请号201820848148.4、名称为：用于捕获目标细胞或生物分子的富集筛选机构的中国专利中公开了可以采用富集筛选机构对循环肿瘤细胞进行富集以及后续的检测操作。但是研究人员发现，现有的富集和检测方法中，血液中红细胞的处理较为繁琐，无法避免红细胞对富集和检测循环肿瘤细胞过程中的影响，且在操作过程中循环肿瘤细胞的丢失严重。

发明内容

有鉴于此，为了达到上述目的和解决现有技术的问题，本发明提供了一种改进的循环肿瘤细胞的检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下的技术方案：

一种循环肿瘤细胞的检测方法，包括如下步骤：

1）待测血液处理：采用密度梯度离心法对待测血液进行离心，离心后体系至少分为四层，其中待测血液中的红细胞进入最下层，白细胞和循环肿瘤细胞处于自上而下的第二层，将其中所述第二层与其他层分离并取出，得到检测液；通过将白细胞和循环肿瘤细胞单独取出，能够有效避免红细胞对后续操作的干扰；