[发明专利]口蹄疫病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒

说明书

本发明选择口蹄疫病毒高度保守的3D基因片段作为检测靶基因，设计特异性引物建立FMDV特异性的荧光等温扩增检测方法。本发明采用Bst DNA聚合酶，具有扩增效率高、特异性好的优点；采用荧光染料指示反应结果，便于准确判定；无需提取样品DNA,简化了检测操作；整个检测过程速度快，只需50min。且本发明一次可检测多个样品，适于大批样品的检测。所用的荧光恒温扩增仪器成本低；具有扩增效率高、特异性好的优点；可以用于动物血液和组织中的口蹄疫病毒检测。

技术领域

本发明涉及一种口蹄疫病毒核酸荧光等温扩增检测技术及成套试剂盒，属于微生物检测技术领域。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒 (foot-and-mouth disease virus, FMDV) 引起的, 发生于牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。世界动物卫生组织将口蹄疫列为必须报告的动物烈性传染病, 严重危害畜牧业的发展及相关产品对外贸易。患口蹄疫的动物特征是:会出现发热、跛行和在皮肤与皮肤黏膜上出现水疱等症状。恶性口蹄疫还会导致迅速死亡。

发病或处于潜伏期的动物是主要的口蹄疫病毒传染源，该病毒可通过空气、分泌物和排泄物，以及被污染的饲料等多种途径传播。对口蹄疫的控制措施包括：强化灭活疫苗免疫接种；加强疫情监测和报告，建立有效的主动检测、预报、预警机制；建立健全应急机制，完善应急预案；严格对移动动物、动物产品的检疫监管。

口蹄疫病毒检测是开展疫病诊断和检疫的重要依据。病毒感染相关抗原（VIAA）琼脂扩散试验主要用于疫情普查和活畜进出口检疫，仅能对动物是否存在口蹄疫病毒感染抗体进行检测，耗时一天以上。

当前各级兽医实验室在检测口蹄疫病毒时，主要采用普通RT-PCR方法和荧光RT-PCR方法，但普通RT-PCR检测操作容易造成病毒核酸扩增产物的污染，造成假阳性；而荧光RT-PCR技术则需要价格昂贵的荧光PCR仪，从核酸提取到完成全部检测过程，通常需要2个小时以上。近年来我国对动物及其产品检疫要求开展病原学检测，依据检测结果出具检疫证明，这就需要更快速、简便、准确、低廉并适合在现场应用的FMDV检测技术。

核酸等温扩增技术是一种新兴的基因检测技术,与广泛应用的普通RT-PCR和荧光RT-PCR相比，具有许多优点。该方法不需要贵重仪器（恒温即可）、操作简单、速度快、灵敏度高，因此得到越来越广泛的应用。但现有的核酸等温扩增方法，主要依靠肉眼观察反应溶液的颜色变化来判定结果，其主观性强、准确性差。

本发明采用荧光剂对双链DNA扩增产物进行染色，用阅读仪检测荧光信号来判定结果，比眼观法提高了准确性；本发明采用免提取反应液，处理并释放样品中的病毒RNA，直接进行扩增反应，不必提取样品中的RNA，减少了操作步骤和成本，缩短了检测时间，消除了核酸提取过程中的交叉污染；本发明针对口蹄疫病毒基因设计了6条特异性引物，从而保证扩增反应的特异性。

本发明综合运用这些技术，最终建立了新的口蹄疫病毒核酸快速检测方法和试剂盒。本发明相比目前广泛使用的PCR和荧光PCR检测方法，具有检测速度快、灵敏度高、操作简便、试剂与设备成本低等优点，适合在动物养殖、屠宰、检疫、监测的现场和基层单位使用，具有良好应用前景。

发明内容

本发明的目的是建立免提取核酸的口蹄疫病毒荧光等温扩增检测方法及试剂盒，使检测过程简便易行，结果判读精确，不用借助昂贵仪器，降低检测成本，检测总时间缩短至50分钟，为口蹄疫病毒检测提供快速、灵敏、特异、低成本的技术手段。

为实现上述发明目的，本发明综合运用Bst DNA聚合酶等温扩增技术、组织样本核酸免提取技术和荧光指示剂，建立口蹄疫病毒荧光等温扩增检测方法，研制成试剂盒，具体内容如下：

1.等温扩增引物设计：参考口蹄疫病毒基因组的核苷酸序列，筛选3D基因保守区域，设计6条引物：

FMDF3 ACCCTCGARGCTATC

FMDB3 GCGTCACCGCACAC