[发明专利]一种检测血液中HBV pgRNA的试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测血液中HBV pgRNA的试剂盒，属于分子生物学技术领域，试剂盒包括扩增试剂，扩增试剂包括PCR反应液Ⅰ，PCR反应液Ⅰ包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的探针。本发明提供的试剂盒，利用RNA单链需逆转录的特点，在逆转录引物的5’端增加一段特异的非HBV的序列，同时将合成该段序列的寡核苷酸作为cDNA扩增的引物，达到特异性扩增pgRNA的目的，检测过程中不受DNA干扰，有效提高了试剂盒检测时的灵敏度，对乙肝病毒pgRNA的检测下限可达10copies/ml。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测血液中HBV pgRNA的试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起肝脏疾病，如肝硬化和原发性肝癌，最常见的病因之一。全球超过20亿人感染了乙肝病毒，约有2.4亿慢性乙型肝炎患者，我国约有9300万慢性乙肝病毒携带者，其中发展为慢性乙型肝炎的患者约2000～3000万人。

乙型肝炎病毒属于嗜肝性DNA病毒，病毒侵入人体后，通过preS1区域与肝细胞膜上钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白受体结合，脱去包膜后进入肝细胞质，释放松环DNA(rcDNA)进入肝细胞核，在肝细胞核中rcDNA转变成共价闭合环状DNA(cccDNA)，再以cccDNA为模板转录出4种mRNA，其中长度3.5Kb的前基因组RNA(pgRNA)包含HBV DNA上的所有遗传信息，并且pgRNA能够在胞质中逆转录形成rcDNA和病毒蛋白，最后装配成完整的HBV，释放至肝细胞外，而一部分rcDNA进入细胞核中，再转变成cccDNA，形成乙肝病毒持续复制的过程。

cccDNA能以游离的形态长期稳定存在于肝细胞核中，所以cccDNA的水平与乙肝复发有极大的相关性，而cccDNA的检测需要对患者肝脏进行穿刺取样，侵入性检查会对患者造成一定伤害。有研究表明慢性乙肝患者血清中存在pgRNA，pgRNA来源于非整合的完整的HBV基因组，以衣壳化HBV pgRNA病毒颗粒形式进入血液中，pgRNA能够反映肝脏内cccDNA的转录活动状态，在HBeAg阳性HBV感染者中，血清pgRNA与肝内cccDNA的水平呈正相关，所以pgRNA可以作为HBV病毒复制和预后的敏感性血清标志物，HBV pgRNA持续阴性和低HBsAg水平可以判定为慢性乙型肝炎的“准临床治愈”，在指导乙肝治疗安全停药方面具有重要意义。但目前市场上用于检测pgRNA的技术和试剂盒较少，且pgRNA的检测易受到来自DNA的干扰，已有产品的灵敏度不能满足实际需求。虽然申请号为201611099305.8的中国发明专利，公开了一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒，其能够对血液中的HBV pgRNA定量检测，且灵敏度可低至5个拷贝，但是其检测是基于数字PCR技术，而基于荧光定量PCR检测技术的试剂盒还无法达到上述灵敏度。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种利用荧光定量PCR检测技术的高灵敏度HBV pgRNA检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种检测血液中HBV pgRNA的试剂盒，包括扩增试剂，所述扩增试剂包括PCR反应液Ⅰ，所述PCR反应液Ⅰ包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的探针(见表1)。

表1

本发明的有益效果在于：本发明提供的试剂盒，利用RNA单链需逆转录的特点，在逆转录引物的5’端增加一段特异的非HBV的序列，同时将合成该段序列的寡核苷酸作为cDNA扩增的引物，达到特异性扩增pgRNA的目的，使得检测过程中不受DNA干扰，有效提高了试剂盒检测时的灵敏度，对乙肝病毒pgRNA的检测下限(最低检出限)可达10copies/ml。

附图说明