[发明专利]一种从人胎盘底蜕膜组织中分离母体来源间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种从人胎盘底蜕膜组织中分离母体来源间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

胎盘底蜕膜间充质干细胞制备；从各项传染病检测均合格的母体，收集胎盘组织及母血样本，无菌储运；样本初步检查；母血样本分装，胎盘组织进行无菌清洗后撕取底蜕膜组织，将底蜕膜组织剪碎均匀铺于T175培养瓶中，在培养箱中水平放置2小时后加入培养基，静止培养7天后，进行换液处理；待细胞量≥1×10⁶时，进行传代处理；

（2）胎盘底蜕膜间充质干细胞的传代培养；取出准备传代的胎盘底蜕膜间充质干细胞细胞，吸掉培养基；加0.25%胰酶消化细胞，终止消化，将细胞轻柔吹吸后转移至离心管中，并用生理盐水洗涤培养瓶一次，将洗涤的细胞离心；吸弃离心后的上清，用无血清培养基重悬细胞沉淀，台盼兰染色细胞计数，调整细胞密度为4.0×10⁵/ml，每个T175培养瓶先加23.0ml MSC完全培养基，再加2.0ml细胞悬液，混匀后放置于培养箱中静止培养；

（3）细胞收获、冻存；细胞生长至80~90%时对细胞进行消化，消化的细胞洗涤、离心，收集细胞沉淀，取样进行检测，检测合格后重悬细胞，收获包装并冻存；冻存程序为：a．在4℃等待，直至产品放入；b. 以1℃/min降至0℃，保持5min；c．以1℃/min降至-10℃，保持5min；d．以1℃/min降至-45℃，保持20min；e．以5℃/min降至-90℃，保持5min；f.结束；

（4）STR鉴定样本准备：步骤（1）中分装的母血样本中的母血球用于STR鉴定的母体样本；取1×10⁴的P2代细胞铺于1个T25培养瓶中，待细胞生长到60%-70%时，加入足量MSC完全培养基，使培养基充满整个培养瓶；将上述母血球和T25培养瓶中的细胞做好标注，一同寄往检测机构检测。

2.根据权利要求1所述的一种从人胎盘底蜕膜组织中分离母体来源间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤（1）胎盘底蜕膜间充质干细胞制备，包括以下具体步骤：

1）样本筛选及采集：选取各项传染病检测均合格的客户，剖腹产后收集胎盘组织及母血样本5ml；胎盘用生理盐水冲洗后置于无菌采集袋中，倒入500ml胎盘储运液，封口，再将无菌采集袋置于生物安全样本袋中，放置于储运盒内，在4-10℃条件下运送至实验室；所述胎盘储运液配方为：500ml PBS+ 320U/ml硫酸庆大霉素+25μg/ml两性霉素B；

2）样本初步检查：开箱检查储运液有无渗漏，胎盘储运袋及母血抗凝管标签是否完整、准确，交接表内容是否齐全；

3）母血样本分装：准备EP管并粘贴条码，其中7个EP管标注母血“m”，将母血采用1500rpm/5min离心后分装，离心母血并分装上清液，装入4支EP管中， 1支按照第三方检测单次检测用量需要分装后送检，用于传染病五项和ALT检测；剩余血浆平分至3支EP冻存用于复核复检，每支0.5m~1ml；母血球转到另外3支EP管中，与母血浆一起冷冻保存，登记样本储存位置；

4）胎盘组织进行无菌清洗：准备2支50mL离心管分别加入20mL 75%医用酒精，作为工具放置管，分别插入1把医用剪刀和2把医用镊子；将无菌袋表面喷酒精消毒后置无菌台，将无菌袋近1/2 处正反两次折叠，并分别用浸润有医用酒精的无尘纸消毒，用第一套工具管中的剪刀将无菌袋从折叠线处剪开；将储运液尽可能完全倒弃，加入生理盐水300mL，手持无菌袋两侧使胎盘样本在生理盐水洗液中充分荡洗，在无菌袋中重复加入生理盐水清洗3次，每次清洗应将前一次液尽可能倒弃完全；在无菌袋中清洗胎盘样本3次后，转至无菌不锈钢盒中继续加生理盐水清洗，每次加入生理盐水300mL，清洗3次；

5）撕取底蜕膜组织：将清洗后的胎盘组织放置于装有10ml生理盐水的50ml离心管中，加20mL生理盐水清洗组织块至少5次，每次清洗后将组织转移至新的离心管中继续荡洗；用镊子去除底蜕膜上的红色组织，只留下白色且略透明的底蜕膜组织；充分剪碎底蜕膜组织块，将组织块均匀铺于T 75培养瓶中，在培养箱中水平放置2小时后加入15ml MSC完全培养基；静止培养7天后，进行换液处理；待细胞量≥1×10⁶进行传代处理；所述 MSC完全培养基配方为：无血清培养基+5ng/ml EGF+7ng/ml PDGF + 5ng/ml FGF+5ng/ml IFN-γ+ 5ng/mlTNF-α+2% L-GlutaMAX。