[发明专利]一种土壤中噬菌体提取富集的方法

说明书

一种土壤中噬菌体提取富集的方法，首先将鲜土以一定比例与柠檬酸钾缓冲液混合，放置于低温孵化一段时间，然后提取液将通过超声震荡处理从土壤颗粒中提取土壤噬菌体。土壤悬浊液经多次离心操作后取得上清液，经灭菌滤膜依次过滤除菌后，使用切向流过滤/超滤技术缩小滤液体积，进行噬菌体富集。使用聚乙二醇沉淀的方式回收噬菌体，低温放置过夜，第二天经离心、TE缓冲液溶解后再次过滤膜除菌，使用核酸酶消化样品中的杂质DNA和RNA。最终得到的浓缩液可以进行后续DNA提取及样品固定等操作。

技术领域

本发明属于土壤生物学领域，尤其涉及一种土壤中噬菌体提取富集的方法。

背景技术

侵染原核微生物的病毒被称为噬菌体，是目前已知自然环境中丰度最大的生物体；且由于土壤中原核微生物（细菌和古菌）的数量远大于真核生物，因此噬菌体是土壤中主要的病毒类群。噬菌体通过吸附、注入、增殖（复制与生物合成）、成熟（装配）和释放五个阶段，完成对宿主细菌的捕食，在土壤中发挥着重要作用：噬菌体裂解细菌，影响细菌生理代谢，从而影响生态系统中微生物的群落结构及多样性；细菌裂解后释放有机物将影响元素的生物地球化学循环；细菌DNA由于裂解释放到环境中或者被噬菌体转移，引起微生物遗传变异，推动微生物种群进化。因此，土壤噬菌体群落在生态系统中扮演着重要角色。另外，由于噬菌体专性裂解细菌的特性，有关于噬菌体的研究工作多从实用角度出发，如在病原菌检测、控制生物膜污染、噬菌体疗法防治细菌性疾病或病害等方面，噬菌体均显现出巨大潜力。然而，由于土壤环境的复杂性，大部分噬菌体被土壤颗粒吸附而固定，其他部分以溶原状态存在于寄主细菌中，只有极少部分噬菌体以游离状态存在，目前未有可靠的办法能够从土壤中高效地提取、富集噬菌体。因此研究高效、稳定地土壤噬菌体提取方法是进一步了解土壤环境生物结构功能，促进土壤噬菌体的研究、应用的必要保证。

目前，针对噬菌体的研究，大多采用特定细菌靶向筛选出对应噬菌体的形式。其中，申请号：CN201610377461.X提供了一种快速筛选噬菌体的方法，该方法通过悬浊液过滤离心的方式获得噬菌体溶液，将细菌在固体平板上以划平行长线的方式接种后，再将噬菌体悬液以划平行短线的方式垂直于细菌长线接种，使细菌和噬菌体形成垂直交叉，所得培养皿置于生长条件下12-36小时之后，若在细菌和噬菌体的交叉处有裂解现象，则将板内对应的噬菌体再次与宿主菌混合扩大培养。但该技术的前提为细菌已被培养出，因此得到的噬菌体种类单一，不能展示土壤噬菌体群落的全貌；无法对不可培养细菌进行噬菌体筛选，也限制了实用性。

通过专利检索，未发现有关提取、富集土壤噬菌体的方法公开发表和受理，与本发明最接近的现有技术是从粪便或污泥中提取富集噬菌体的方法。申请号：CN201910280829.4提供了一种从好氧颗粒污泥中高效提取富集噬菌体的方法，该方法对污泥研磨后加入糖化水解酶去除胞外聚合物、释放噬菌体，而后震荡提取、浓缩，得到噬菌体颗粒，污泥与土壤环境相比富含大量水分和胞外聚合物，胞外聚合物被水解后噬菌体可以很快释放到水相中；而土壤因缺少游离水和较强的静电吸附作用，必须选择添加合适的缓冲提取液将噬菌体转移至水相中。申请号：CN201810394101.X提供了一种从粪便中获得噬菌体的方法，其采用粪便和SM缓冲液混合后涡旋震荡的方式，将粪便中的噬菌体释放到缓冲液中，而后过滤、富集。而土壤由于所需样品量大、提取液用量多， 由于SM缓冲液中含有分子量为几万至十几万的明胶，使用起来将过膜困难，操作耗时耗力；且后期噬菌体富集过程中，采用100kDa超滤孔径会使大量土壤噬菌体通过滤膜，噬菌体获得率低。因此，这两种方法均不适用于土壤中的噬菌体提取与富集。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供了一种土壤中噬菌体提取富集的方法，该方法可以有效地对土壤噬菌体进行提取，便于后续研究对土壤噬菌体群落的调查与利用。将超声后的土壤噬菌体浸提液过滤除菌、切向流与聚乙二醇沉淀进行富集，获得的噬菌体可以最大化展示土壤噬菌体群落全貌，是一种操作简便且准确的方法。