[发明专利]含黑色素的表皮皮肤模型及其构建方法和应用

权利要求书

1.含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述含黑色素的表皮皮肤模型由上而下的结构依次为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层，所述含黑色素的表皮皮肤模型中含有黑色素细胞，所述含黑色素的表皮皮肤模型采用原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物经体外共培养、液下培养和气液面培养而成。

2.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞混合物的获取方法为：将离体的人体皮肤组织清洗干净后，去除皮下疏松结缔组织，浸没于Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶/EDTA消化液中浸泡10～15 分钟，加入终止液，用弯头吸管轻柔吹打100～200次，过滤、离心后得原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物。

3.根据权利要求2所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述人体皮肤组织在清洗前经质量分数为70～80%的乙醇浸泡10～90秒。

4.根据权利要求2所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述Dispase酶消化液中Dispase酶的用量为1.2U/mL，质量分数为1%。

5.根据权利要求2所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，每100mL所述胰酶/EDTA消化液中含0.025～0.05g胰酶、0.01g的EDTA。

6.根据权利要求2所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述终止液为含10%血清的DMEM。

7.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞体外共培养的过程为：取所述原代人表皮细胞与黑色素细胞混合物，加入第一细胞培养基，吹打成均匀的细胞悬液，并以3.5×105～7.5×105/瓶的密度接种至T75培养瓶，置于5% CO₂、37℃培养箱中孵育5～7天，隔天换液，获得人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物。

8.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述原代人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物中人表皮角质形成细胞与黑色素细胞的比例为40:1～9:1。

9.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述第一培养基的配方为：在人表皮角质形成细胞培养基KC-Growth中，添加10～30μL/10⁶cells的整合素α3β1、10～50ng的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯。

10.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述液下培养的过程为：将所述人表皮角质形成细胞与黑色素细胞扩增产物用第二培养基进行重悬，接种于底面积为0.5cm²的Transwell小室中，接种密度为2.0×10⁵～5.0×10⁵/室，在小室内外加入第二培养基，保持该细胞小室内的液量为150～200μL，在5% CO₂、37℃的细胞培养箱中孵育1～3天，每天换液，制备成模型细胞层，所述模型细胞层包含基底细胞层，所述基底细胞层下表面具有一层半桥粒蛋白。

11.根据权利要求1所述的含黑色素的表皮皮肤模型,其特征在于，所述第二培养基的组分为：以含有KC-Growth基础培养基500mL计，包含表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素2～10μg、氢化可的松10～50μg、牛脑垂体提取物10～100mg、整合素α3β1 10～30μL/106cells、12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯10～50ng。