[发明专利]基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和应用，包括针对本氏烟UbEF1B基因构建的BKG‑g10、BKG‑g11载体和/或针对本氏烟CCR4/NOT基因构建的BKG‑g12、BKG‑g13载体。上述载体将UbEF1B基因或CCR4/NOT基因编辑后本氏烟生长状态正常，表型相较于野生型未发生明显变化；不会对其性状产生影响，利于后代的延续。依靠CRISPR/Cas9系统编辑本氏烟内源基因相较于传统的育种方法能更快更有效的获得抗病材料。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和应用。

背景技术

云南番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Yunnan virus,TLCYnV)主要通过烟粉虱传播，受感染的植株生长缓慢、叶片褪绿、扭曲，危害轻则导致减产，重则导致绝收。目前，该病毒引起的病害由于治理困难，已经在多种作物上造成了严重的危害，除了以预防为主的防治措施外，需要极寻求更为有效的防治措施，比如抗病品种的选育和种植。

现阶段，虽然在寄主植物中鉴定到了一些与双生病毒相关的内源基因，但尚未在农业生产生活中提高其进一步的应用价值。而且本氏烟作为双生病毒研究的重要模式植物，获得更多的抗病品种在接下来的病毒致病，寄主抗病机理的研究中尤为重要。

在当前的背景条件下，双生病毒的防治还有很大的空白需要填写：

(1)在目前的条件下，田间抗病毒工程多以预防为主，防治结合，田间选育抗病品种费时费力，而且往往达不到预想的效果；

(2)本氏烟作为双生病毒研究的重要模式植物，相关的抗双生病毒品种需要进一步的完善，这样才能更好的揭示病毒与植物互作的机制；

(3)双生病毒多依靠昆虫媒介进行传播，大量化学试剂的使用严重污染了环境以及生物安全；

(4)目前利用本氏烟内源基因进行抗病毒研究的载体多存在抗病效果不稳定或影响寄主植物原表型，效果不理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和应用。本发明通过设计针对TLCYnV研究的模式植物本氏烟的UbEF1B以及CCR4/NOT基因gRNA，构建了利用编辑上述内源基因实现抗双生病毒的农杆菌侵染性克隆载体。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体，包括针对本氏烟UbEF1B基因构建的pCambia 1300-BKG-g10、pCambia 1300-BKG-g11(简称BKG-g10、BKG-g11)和/或针对本氏烟CCR4/NOT基因构建的pCambia 1300-BKG-g12、pCambia 1300-BKG-g13载体(简称BKG-g12、BKG-g13)。

上述载体的构建方法为：在本氏烟UbEF1B基因CDS区的序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g10,BKG-g11载体分别所需的两个靶点的四条gRNA链，如SEQ ID：NO.1-NO.4所示；并将上述单链gRNA合成为双链；

在本氏烟CCR4/NOT基因的CDS区序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括BKG-g12,BKG-g13载体分别所需的两个靶点的四条gRNA链，如SEQ ID：NO.5-NO.8所示；并将上述单链gRNA合成为双链。

其中，所述BKG-g10载体的构建包括以下步骤：

①BsaI酶切BKG质粒，然后纯化回收DNA片段，-20℃冷冻保存；

②将酶切后的BKG载体与双链化的gRNA用T4DNA连接酶进行连接；