[发明专利]基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)的载体及其构建方法和应用，包括针对中国番茄黄化曲叶病毒TYLCCNV的复制核心区(Iteron区)构建的pCambia 1300‑BKG‑g4、pCambia 1300‑BKG‑g5和pCambia 1300‑BKG‑g6；还包括针对中国番茄黄化曲叶病毒beta(TYLCCNB)的Iteron区构建的pCambia 1300‑BKG‑g1、pCambia 1300‑BKG‑g2和pCambia 1300‑BKG‑g3。此套载体依靠CRISPR/Cas9系统，可以实现对TYLCCNV/TYLCCNB序列的定点编辑，并且编辑效率高。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR/Cas9系统靶标并编辑中国番茄黄化曲叶病毒复制核心区来抑制双生病毒侵染的载体构建方法。

背景技术

中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)属于双生病毒科，菜豆金色花叶病毒属病毒。该病毒在田间常伴随有卫星分子中国番茄黄化曲叶病毒卫星beta(Tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB)，TYLCCNV与TYLCCNB复合侵染后形成的病害复合物对我国田间番茄等蔬菜作物造成毁灭性的危害。该病毒主要通过烟粉虱传播，感病的番茄植株生长缓慢或停滞，矮化严重，新叶褪绿发黄、变小、边缘上卷。目前该病害在田间主要治理手段仍以预防为主，切断其传播媒介是主要的防治方法。然而，由于治理困难，该病毒已经在多种作物上造成了严重的危害，对我国农业生产安全造成了巨大破坏，寻找更为有效的防治措施尤为关键。

鉴于目前生产中无有效的抗TYLCCNV/TYLCCNB的植物品种。先前通过利用Cas9技术靶标其他双生病毒的IR区，获得的植物的抗病效果并不理想。当前条件下，在田间防治双生病毒还有很多掣肘：(1)植物病毒素有“植物癌症”之说，田间防治困难，由于生物，物理以及化学防治效果均不理想，目前田间抗病毒工程多以预防为主，防治结合；(2)双生病毒多依靠昆虫媒介进行传播，因此控制田间农作物取食昆虫是切断其传播途径最有效的方法，这样就避免不了化学试剂的大规模使用，农药残留问题以及对非靶标生物安全问题摆在了人们面前，并在短时间内难以解决；(3)育种方面，抗双生病毒农作物品种培育缓慢，田间效果不理想，存在潜在的极大不确定因素。(4)目前利用CRISPR/Cas9技术针对植物病毒序列进行编辑多选择在双生病毒IR区，抗病毒效果在不同病毒间具有较大差异，并没有较好的特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体及其构建方法和应用。本发明基于CRISPR/Cas9系统靶标并编辑TYLCCNV/TYLCCNB复制核心区(Iteron区)来抑制双生病毒侵染的载体具有显著高效的抗病毒的功能，而作用靶点是由本实验室鉴定出的与病毒复制直接相关的Iteron区域，通过阻碍病毒的复制来达到抗病毒效果，具有更高的特异性和抗病性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体，包括针对中国番茄黄化曲叶病毒TYLCCNV的Iteron区构建的pCambia 1300-BKG-g4、pCambia 1300-BKG-g5和pCambia 1300-BKG-g6，简称BKG-g4、BKG-g5和BKG-g6；

还包括针对中国番茄黄化曲叶病毒beta(TYLCCNB)的Iteron区构建的pCambia

1300-BKG-g1、pCambia 1300-BKG-g2和pCambia 1300-BKG-g3，简称BKG-g1、BKG-g2和BKG-g3。

基于CRISPR/Cas9系统编辑中国番茄黄化曲叶病毒的载体的构建方法：